lncRNA XIST通过miR-92a-3p/CYLD轴促进坏死性凋亡，从而抑制急性髓系白血病的进展

《Cellular Signalling》：lncRNA XIST suppresses acute myeloid leukemia progression by promoting necroptosis through the miR-92a-3p/CYLD axis

　　

摘要

急性髓系白血病仍是一种致命性极高的血液系统恶性肿瘤，其复发和治疗效果不佳很大程度上源于细胞对凋亡的逃避。坏死性凋亡作为一种受调控的非凋亡性细胞死亡方式，被视作消除具有凋亡抗性的癌细胞的潜在策略；然而，其在急性髓系白血病中的上游调控机制至今尚未完全明了。

在本研究中，我们发现长链非编码RNA XIST是急性髓系白血病中坏死性凋亡相关信号传导途径中一个此前未被充分重视的调控因子。在急性髓系白血病细胞系及患者原始样本中，XIST和CYLD的表达始终处于下调状态，而miR-92a-3p则表达升高，且与XIST和CYLD的表达呈负相关。从临床角度来看，miR-92a-3p表达水平较高会降低急性髓系白血病患者的总体生存率。

在功能层面，内源性的XIST激活能够显著抑制急性髓系白血病细胞的增殖，并引发G2/M期细胞周期停滞，同时不会明显增加细胞凋亡。相反，XIST过表达会通过台盼蓝染色和Hoechst/PI染色观察到膜结构破坏导致的细胞死亡，还会引发类似坏死性凋亡的超微结构变化。Necrostatin-1这种坏死性凋亡抑制剂可部分逆转XIST介导的生长抑制作用，但泛半胱天冬酶抑制剂zVAD-fmk则无法做到这一点。此外，XIST过表达还能提升CYLD的表达水平，并激活与坏死性凋亡相关的RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路，表现为RIPK1、RIPK3和MLKL的磷酸化水平上升。从机制上来看，XIST会直接与miR-92a-3p相互作用并抑制其表达，而miR-92a-3p则会直接靶向CYLD。抑制miR-92a-3p的表达能够提升CYLD的水平，进而重现XIST所具有的抗增殖作用以及与坏死性凋亡相关的效应。在体内实验中，XIST过表达也能抑制皮下移植的急性髓系白血病肿瘤的生长，并增强与坏死性凋亡相关的信号传导。

综上所述，我们的研究结果表明，XIST至少在一定程度上是通过调控miR-92a-3p/CYLD轴并促进坏死性凋亡相关的细胞死亡来抑制急性髓系白血病的进展的，这一发现为克服急性髓系白血病中的凋亡抗性提供了潜在的调控机制。

引言

急性髓系白血病是一种侵袭性极强的血液系统恶性肿瘤，其特征为未成熟髓系前体细胞的克隆性扩增以及造血功能受损。尽管在分子风险分层和靶向治疗方面已经取得了显著进展，但临床治疗效果依然不尽如人意，尤其是对于那些疾病复发或对现有治疗产生耐药性的患者[1]、[2]。治疗面临的一个主要障碍就是癌细胞获得了对凋亡的抵抗能力，这不仅限制了常规治疗和靶向治疗的细胞毒性效果，还会导致疾病持续存在和复发[3]、[4]。这些问题凸显出有必要寻找其他可以用于治疗、从而消除具有凋亡抗性的白血病细胞的细胞死亡途径。

坏死性凋亡是一种由RIPK1/RIPK3/MLKL信号级联反应介导的、受调控的非凋亡性细胞死亡方式。与凋亡不同，坏死性凋亡不依赖半胱天冬酶，已被证明能够杀死那些能够逃避凋亡信号传导的癌细胞[5]、[6]、[7]、[8]、[9]。越来越多的证据表明，坏死性凋亡并非仅仅是备用的死亡途径，而是一个受到转录程序和信号网络整合严格调控的过程[7]、[8]。在血液系统恶性肿瘤中，激活坏死性凋亡被认为是一种克服治疗耐药性的策略；然而，急性髓系白血病中调控坏死性凋亡相关信号激活的上游机制目前仍未完全明确[10]、[11]、[12]。

非编码RNA已被证实是基因表达和癌症生物学过程的关键调控因子，尤其通过转录后和表观遗传机制发挥作用[13]。长链非编码RNA可以通过作为竞争性内源RNA来调节微小RNA的浓度，进而影响下游的信号传导网络。X染色体失活特异性转录本XIST是一种功能已较为明确的参与X染色体失活的长链非编码RNA，越来越多的研究表明它在不同背景下可通过特定的调控功能推动肿瘤的发展[14]、[15]、[16]。不过，它在急性髓系白血病中的作用，尤其是在调控坏死性凋亡相关信号传导等非凋亡性细胞死亡途径方面的作用，目前仍不明确。

微小RNA是参与白血病发生的重要的转录后调控因子。miR-17-92家族中的miR-92a-3p已被广泛认为与造血系统的转化以及白血病的进展有关[17]、[18]、[19]、[20]。值得注意的是，我们之前的研究已经证明，紫草素可以通过miR-92a-1-5p/MLKL轴在慢性髓系白血病细胞中诱导坏死性凋亡，从而帮助克服酪氨酸激酶抑制剂的耐药性[21]。此外，越来越多的证据表明，微小RNA可以通过靶向信号级联反应中的关键成分来直接调控坏死性凋亡[22]。这些发现说明，微小RNA介导的调控网络可能是控制白血病中坏死性凋亡的重要上游环节。不过，miR-92a-3p是否在急性髓系白血病中调控坏死性凋亡相关信号传导，以及这一过程是如何融入更广泛的非编码RNA调控网络中的，目前仍不清楚。

CYLD是一种去泛素化酶，是坏死性凋亡的核心调控因子，能够调控RIPK1的泛素化过程以及坏死小体的形成[6]。CYLD的功能失调与细胞死亡信号传导异常以及癌症进展之间存在关联[7]。虽然CYLD已被确认为坏死性凋亡相关信号传导的重要介质，但它在中急性髓系白血病中如何受到非编码RNA网络的调控，目前尚未完全阐明。

基于上述观察，我们推测在急性髓系白血病中，可能存在一种长链非编码RNA-微小RNA调控轴，在坏死性凋亡相关信号传导之前起调控作用。在本研究中，我们发现XIST是一种在特定背景下能抑制急性髓系白血病进展的调控因子，它的作用至少部分是通过miR-92a-3p/CYLD依赖的途径实现的。据我们所知，这是首项将长链非编码RNA-微小RNA调控轴与急性髓系白血病中的坏死性凋亡相关信号传导联系起来，并且证明调控这一轴可以通过非凋亡性细胞死亡途径影响白血病细胞命运的研究。我们的发现拓展了人们对急性髓系白血病中坏死性凋亡调控机制的理解，也为进一步研究具有凋亡抗性的白血病中的非编码RNA网络提供了理论依据。

章节节选

细胞系与原始急性髓系白血病样本

人类急性髓系白血病细胞系THP-1、HL-60和U937，以及HEK293T细胞，均来自中国科学院细胞库。我们对这些细胞系进行了STR基因分型鉴定，确认所有细胞系在使用前均无支原体污染。THP-1、HL-60和U937细胞在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基（Gibco，美国）中培养，而HEK293T细胞则在含有10%成分的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Gibco）中培养

急性髓系白血病中XIST和CYLD表达下调，而miR-92a-3p表达升高且与不良预后相关

为了初步评估XIST/miR-92a-3p/CYLD轴在急性髓系白血病中的作用，我们首先检测了这些因子在急性髓系白血病细胞系中的基础表达水平。RT-qPCR分析结果显示，与外周血单核细胞相比，HL-60、THP-1和U937细胞中的XIST和CYLD表达水平显著下降，而miR-92a-3p在这些急性髓系白血病细胞系中的表达水平则明显升高（图1A）。这些发现提示

讨论

急性髓系白血病仍是一种生物学特性复杂、临床治疗难度较高的恶性肿瘤，其复发和治疗失败往往与细胞死亡反应无效有关[1]、[2]、[3]、[4]。与这一观点相符，我们的研究发现了长链非编码RNA XIST是一种在特定背景下发挥作用的调控因子，它在急性髓系白血病中的坏死性凋亡相关信号传导过程中起着此前未被充分重视的作用。我们发现XIST在急性髓系白血病细胞系及患者原始样本中的表达水平处于下调状态，而miR-92a-3p则

结论

总之，我们的研究确定XIST是一种在急性髓系白血病中起抑制作用的长链非编码RNA，它将非编码RNA的调控作用与坏死性凋亡相关信号传导联系在一起。XIST至少部分是通过调控miR-92a-3p/CYLD轴并激活RIPK1/RIPK3/MLKL相关的信号通路来限制白血病细胞的生长，从而在体外和体内促进坏死性凋亡相关的细胞死亡表型。这些发现进一步完善了当前关于如何通过替代途径针对具有凋亡抗性的白血病的研究框架

CRediT作者贡献说明

黄贤波：论文撰写——初稿撰写、研究指导、方法设计、资金申请、概念构思。陈颖：论文撰写——初稿撰写、结果验证、实验研究、正式数据分析、数据整理。任艳玲：结果验证、实验研究、数据整理。王莎莎：结果验证、实验研究。梅晨：实验研究、正式数据分析。徐宇：正式数据分析、数据整理。金杰：研究指导、资源协调。童红燕：论文撰写——审阅与编辑、研究指导、概念构思。钱洁静：

发表同意声明

所有作者均已审阅该 manuscript，并同意将其发表。

伦理审批与参与者知情同意

本研究中所涉及的所有人类样本处理及相关数据收集工作均遵循《赫尔辛基宣言》的要求，并已获得浙江大学医学院第一附属医院机构伦理委员会的批准（批准编号：IIT20200154A）。在采集样本之前，我们已经获得了所有患者的书面知情同意书。

所有的动物实验也都严格按照相关机构的规定以及国家关于动物实验管理的法规进行

资助情况

本研究得到了中国自然科学基金的资助（项目编号：81900152）。

利益冲突声明

所有作者均声明不存在任何利益冲突。

Xianbo Huang|Ying Chen|Yanling Ren|Shasha Wang|Chen Mei|Yu Xu|Jie Jin|Hongyan Tong|Jiejing Qian

中国杭州，浙江大学医学院第一附属医院血液科