一种新型出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）分离株用于马铃薯腐烂中常见青霉（Penicillium commune）的生物防治及其利用田口（Taguchi）方法优化增强抗真菌活性

《International Microbiology》：A novel Aureobasidium pullulans isolate for the biological control of Penicillium commune in potato decay and its optimization for enhanced antifungal activity using the Taguchi method

　　

常见青霉（Penicillium commune）是引起贮藏马铃薯蓝霉腐烂的重要采后真菌病原体，在全球范围内造成重大经济损失。在本研究中，研究人员从马铃薯叶片分离并鉴定了一株新的附生出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）菌株SBAN-IAUF-1，并评估了其对常见青霉（Penicillium commune）SBAN-IAUF-12的拮抗活性。该新分离株表现出强抑制效果，在体外将病原体生长减少60%，在体内减少69.41%，优于大多数先前研究的出芽短梗霉（A. pullulans）菌株所报道的数值。出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）SBAN-IAUF-1产生的胞外抗真菌代谢物也显示出显著的抗真菌活性，表明胞外抗真菌代谢物在拮抗中起关键作用。为进一步增强胞外抗真菌代谢物活性，研究人员应用了田口（Taguchi）L9正交设计，确定了最佳培养条件并显著提高了胞外抗真菌代谢物活性。L9分析建议的最大化胞外抗真菌代谢物产量的最佳条件为20?°C、培养7天、pH?5和1%（wv^?1）YMB浓度。本研究首次报道了通过田口（Taguchi）方法优化的马铃薯来源出芽短梗霉（A. pullulans）分离株用于控制常见青霉（Penicillium commune）。出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）SBAN-IAUF-1的强生物防治活性凸显了其作为马铃薯蓝霉病采后管理环境安全且有效候选物的潜力。

**研究背景与问题**
马铃薯是全球第四大进口作物，但其采后贮藏过程中易受多种真菌病害侵袭，其中由常见青霉（Penicillium commune）引起的蓝霉病导致严重经济损失。传统化学杀菌剂虽有效，但长期使用引发耐药菌株、致癌风险及环境污染等问题，亟需替代策略。微生物生物防治被视为环境友好型方案，酵母类生防菌因快速增殖、耐逆性强、不产过敏孢子等优势备受关注。出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）已被报道为多种果蔬病害的生防菌，但来自马铃薯农业生态系统的分离株研究不足，且针对其抗真菌代谢产物的优化鲜有探讨。因此，本研究旨在分离并筛选生防酵母，阐明其拮抗机制，并利用田口（Taguchi）统计方法优化其抗真菌活性，为马铃薯采后病害提供新型生防资源。

**研究内容与结论**
研究人员从伊朗伊斯法罕马铃薯腐烂块茎中分离出病原真菌，经分子鉴定（ITS区分析）确认为常见青霉（Penicillium commune）SBAN-IAUF-12；同时从马铃薯叶片表面分离附生酵母，通过杀手活性筛选及18S-rDNA测序鉴定为一株新的出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）SBAN-IAUF-1。体外拮抗试验显示，该酵母使病原菌菌落生长减少60%；体内试验（马铃薯块茎接种）表明，其将腐烂面积降低69.41%，优于多数已报道的出芽短梗霉菌株。胞外抗真菌代谢物活性检测（孔扩散法）证实其产生具有抑菌活性的代谢物，初始活性为15个任意单位（AU）。为提升该活性，研究人员采用田口（Taguchi）L9正交设计，以温度、培养时间、pH及YMB浓度为变量，通过Qualitek 4软件分析确定最优条件：20?°C、7天、pH?5、1%（wv^?1）YMB浓度。验证实验表明，优化后胞外抗真菌代谢物活性从15 AU提高至19 AU。方差分析（ANOVA）显示，YMB浓度和pH对活性贡献最大（分别为43%和36.99%），温度和培养时间影响较小。该研究首次报道了马铃薯来源的出芽短梗霉分离株对常见青霉的生防活性，并首次利用田口方法优化其胞外抗真菌代谢产物，为开发区域特异性、低成本、环境友好的马铃薯采后病害管理策略提供了新候选。论文发表在《International Microbiology》。

**主要技术方法**
1. **病原真菌与酵母的分离鉴定**：从伊朗伊斯法罕的腐烂马铃薯块茎（来源注明）分离真菌，通过形态学观察、科赫氏法则验证致病性，经ITS区扩增测序及系统发育分析（邻接法）鉴定为常见青霉（Penicillium commune）SBAN-IAUF-12；从马铃薯叶片表面分离酵母，通过杀手活性（抑制圈法）筛选，经18S-rDNA扩增测序鉴定为出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）SBAN-IAUF-1。
2. **体外与体内生物防治试验**：体外采用平板对峙法，计算相对抑制率（控制指数CI%）；体内采用马铃薯块茎伤口接种法，14天后测量腐烂直径并计算抑制率。
3. **胞外抗真菌代谢物活性检测**：酵母培养上清液经0.45?μm滤膜过滤，加入含病原菌孢子的YEPD-MB平板孔中，72?h后测量抑菌圈直径，以任意单位（AU）表示（1?AU对应1?mm抑菌圈）。
4. **田口（Taguchi）优化设计**：选取温度（20、25、30?°C）、培养时间（3、5、7天）、pH（4、5、6）及YMB浓度（1%、1.5%、2% wv^?1）四个因素，按L9正交表进行9组实验，以胞外抗真菌活性（AU）为响应值，通过Qualitek 4软件分析最佳条件及因素贡献率。

**研究结果**
- **真菌分离与致病性确认**：从腐烂马铃薯中分离出绿色菌落P9，形态学符合青霉属特征；科赫氏法则验证其在马铃薯块茎上引起典型蓝霉腐烂症状。
- **分子鉴定**：ITS区扩增获得581?bp片段，BLAST分析显示与常见青霉（Penicillium commune）T_S1_F（KP411582.1）相似度98.96%，系统发育树确认其鉴定为常见青霉（Penicillium commune）SBAN-IAUF-12（GenBank登录号PP704689.1）。
- **生防酵母筛选与鉴定**：通过杀手活性测定，PL8菌株在YEPD-MB平板上对病原菌形成明显抑制圈；形态学显示大而软、中央隆起的菌落，细胞呈梭形；18S-rDNA扩增获得800?bp片段，系统发育分析证实其为出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）SBAN-IAUF-1（GenBank登录号OR626047）。
- **体外与体内生防活性**：体外平板对峙结果显示，出芽短梗霉SBAN-IAUF-1将常见青霉生长抑制60%；体内试验中，处理组平均腐烂面积（0.26?cm²）显著低于阳性对照组（0.857?cm²），抑制率达69.41%。
- **胞外抗真菌活性定量**：酵母培养上清液在孔扩散实验中形成清晰抑菌圈，活性为15?AU，表明胞外代谢物是主要拮抗机制。
- **田口优化**：L9实验中，实验2和9活性最高；ANOVA分析显示YMB浓度和pH贡献率分别为43%和36.99%，温度（6.9%）和培养时间（13%）影响较小；最优条件为20?°C、7天、pH?5、1% YMB；验证实验确认活性提升至19?AU。

**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究首次从伊朗当地马铃薯农业生态系统中分离出出芽短梗霉SBAN-IAUF-1，并首次报道其对常见青霉（Penicillium commune）的生防活性。该菌株的体外（60%）和体内（69.41%）抑制率优于或相当于多数已报道的出芽短梗霉菌株，证实其作为生防剂的潜力。田口优化成功提高了胞外抗真菌代谢物活性，其中YMB浓度和pH为关键因素，低营养条件（1% YMB）可能促使酵母进入稳定期并增加次生代谢物分泌，这解释了为何最低营养水平下活性最强。研究还讨论了温度、培养时间等因素的影响，并与前人研究结果一致。局限性包括：未鉴定具体抗真菌化合物、未在块茎上直接验证胞外代谢物效果、实验限于实验室条件、未涉及诱导抗性等间接机制。结论翻译如下：
在本研究中，出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）SBAN-IAUF-1主要通过胞外抗真菌代谢物有效抑制了重要采后马铃薯病原菌常见青霉（Penicillium commune）SBAN-IAUF-12的生长。利用田口（Taguchi）方法优化进一步增强了这些代谢物的抗真菌活性。研究结果表明，出芽短梗霉SBAN-IAUF-1是替代化学杀菌剂用于马铃薯及其他作物采后病害管理的可持续、环境友好型候选物。总体而言，该酵母作为采后真菌病原体生防剂具有强大的商业化潜力。