模块化PheWAS揭示丹红注射液对稳定型心绞痛的治疗异质性景观

《Molecular Biomedicine》：Modular PheWAS reveals the therapeutic heterogeneity landscape of Danghong injection on stable angina pectoris

　　

稳定型心绞痛（SAP）是心肌梗死和死亡的常见危险因素。SAP的基因组学、转录组学和表型组学异质性需要联合治疗。固定剂量的多靶点药物正成为SAP的可扩展且有前景的预防和治疗策略。然而，识别多靶点药物的靶点及其潜在机制以实现最佳临床疗效仍难以攻克。在此，研究人员报告了一项关于丹红注射液（DHI）的模块化表型组关联研究（MoPheWAS），DHI是一种经临床验证有效的抗SAP药物。DHI相互关联的多靶点被分为32个On-modules。由西雅图心绞痛问卷和血清脂质定义的11个临床SAP表型与14个DHI疗效相关的Phe-modules交互关联。SAP表型与Phe-modules之间的内在多态性关联表现为特定一对一以及复杂的多对多关系的系统性正/负调控。这些Phe-modules是保守的、转化的或新出现的模块，涉及G蛋白偶联受体（GPCR）信号和激酶结合。体外RNAi分析证实了Mod-29中的枢纽基因GALR1/BCMO1是DHI抗缺血效应的多靶点。模块化调控因子和多态性表型关联的景观揭示了SAP治疗异质性背后的多靶点机制。因此，MoPheWAS可能为识别复杂多基因疾病的多表型靶点提供一种新的系统性范式。

**论文解读：模块化PheWAS揭示丹红注射液对稳定型心绞痛的治疗异质性机制**

**研究背景与问题**

稳定型心绞痛（SAP）是心肌梗死和死亡的重要危险因素，其基因组、转录组和表型组的异质性要求采用联合治疗方案。传统单靶点药物难以应对SAP复杂的多基因、多表型特征，而固定剂量的多靶点药物（如中药复方）正成为有前景的预防和治疗策略。然而，如何识别多靶点药物疗效依赖的表型异质性背后的靶点与机制，仍是跨学科难题。丹红注射液（DHI）是一种由丹参和红花提取的临床常用抗SAP药物，已证实具有多靶点药理作用（如抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化等），但其在不同临床表型中的治疗异质性机制尚不明确。传统的单靶点研究方法（如全基因组关联研究）难以解析多基因相互作用与表型异质性之间的复杂关联。表型组关联研究（PheWAS）虽能分析遗传变异与多种表型的关联，但针对多靶点药物与多表型数据，仍需创新分析范式。基于模块的网络分析（如加权基因共表达网络分析，WGCNA）可将高度相关的基因集聚为功能模块，更适于反映多靶点药物的整体应答。为此，研究人员提出模块化PheWAS（MoPheWAS）框架，旨在系统揭示DHI治疗SAP的多靶点机制与表型异质性景观。该论文发表在《Molecular Biomedicine》。

**研究方法**

研究人员从一项随机、双盲、安慰剂对照临床试验（ClinicalTrials.gov: NCT01681316）中纳入62例SAP患者（DHI治疗组41例，安慰剂对照组21例，来自两个中心），采集治疗前（D0）和治疗后30天（D30）的血清样本进行高通量转录组测序。基于DHD30（DHI组D30）的mRNA表达数据，采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）构建共表达模块，通过模块保存检验（Zsummary统计量）识别On-modules（药物响应模块），再与11个临床表型（西雅图心绞痛问卷评分、中医血瘀证评分、血脂及C反应蛋白）进行关联分析，筛选出疗效相关的Phe-modules。进一步进行功能富集分析（GO/KEGG）、枢纽基因鉴定及体外RNAi实验验证关键靶点。

**研究结果**

**1. 识别SAP治疗的On-modules**
基于DHD30共表达网络，通过层次聚类得到49个模块（基因数4–11,500个）。经随机2/3和1/2样本保存检验，排除3个未保存模块后，46个模块被保留。其中8个大型模块（>100基因）被重新划分为43个子模块。通过与DHD0和CGD30（对照组D30）比较，以Zsummary<0为标准，鉴定出32个On-modules（潜在的多靶点模块），其中7个模块在两组比较中Zsummary均
**2. SAP临床表型与Phe-modules的关联**
将32个On-modules与11个临床表型（心绞痛频率AF、体力受限PL、心绞痛稳定性AS、治疗满意度TS、生活质量QL、中医血瘀证评分TCM、总胆固醇TC、低密度脂蛋白胆固醇LDL-C、高密度脂蛋白胆固醇HDL-C、甘油三酯TG、C反应蛋白CRP）进行相关分析，发现16个Phe-modules（含2个子模块）与至少一个表型显著相关（|相关系数|>0.3，P<0.05）。其中，8个模块与西雅图心绞痛量表相关，如Mod_24（心绞痛负调控模块）同时与AF、PL、AS、TS四个量表相关；Mod_27（心绞痛正调控模块）与AF、QL、TCM评分相关。血清脂质负调控模块Mod_5和Mod_38一致地与PL、TC、LDL-C、TG相关。另有模块特异性关联CRP（Mod_40，相关系数?0.84）。

**3. 基于模块连通性的Phe-modules枢纽基因**
通过模块成员度（MM）与基因显著性（GS）的相关性，识别各Phe-modules的枢纽基因。例如，Mod_24的枢纽差异表达基因TPTE（MM=0.99）对AF、PL、TS具有高GS；Mod_27的枢纽基因GDNF（MM=0.99）对AF、QL、TCM评分具有高GS；AF特异性Mod_29的枢纽基因包括CDH9、TMEM145、SEBOX、BCMO1和GALR1。

**4. SAP表型与Phe-modules的多态性关联**
SAP表型与Phe-modules呈现系统性正/负调控关系，包括一对一和复杂多对多关联。例如，血清脂质模块Mod_38和Mod_5正调控PL，负调控TC、LDL-C、TG；心绞痛模块Mod_24和Mod_33负调控AS。同时，部分模块对同一表型有相反调控作用，如HDL-C特异性Mod_19正调控、Mod_31负调控HDL-C；TCM评分特异性Mod_8正调控、Mod_43负调控。子模块的表型关联常与原始模块一致，且分解子模块有助于发现隐藏关联，如Mod_32的子模块均与TS正相关，Submod_32-1额外与HDL-C相关。

**5. 模块调控因子的功能评估与注释**
与对照组相比，Phe-modules的基因显著性（GS）显著高于差异表达基因（DEGs），表明模块分析更有效地捕获表型相关信号。与已知冠心病相关基因（2401个）比较，On-modules和Phe-modules分别有127和43个重叠基因，Jaccard相似系数分别为0.035和0.015。功能富集分析显示，On-modules和Phe-modules显著富集于心肌组织形态发生、钾离子跨膜转运、胆固醇稳态、心脏传导、TGF-β信号通路、PI3K-Akt信号通路等。DHI特异性Phe-modules还富集于蛋白激酶结合、G蛋白偶联受体（GPCR）信号、转录因子活性、免疫应答等。

**6. MoPheWAS揭示的SAP治疗异质性景观**
通过将DHI治疗组与对照组的Phe-modules表型关联比较，发现模块呈现保守、转化或新出现三种模式。例如，Mod_5（正调控PL、负调控TC）在两组间保守；对照组中正调控Mod-14经DHI治疗后转化为三个Phe-modules（负调控Mod_24、正调控Mod_27和Mod_29），共同减少AF；Mod_19转化为Mod_40负调控CRP；Mod_8新出现负调控TCM评分。总体景观中，16个Phe-modules以多态性方式关联11个临床表型，4个多效模块与多个表型相关，12个模块与单一表型相关。模块间存在系统性正/负调控串扰，枢纽基因（高MM和高GS）反映了多靶点治疗机制。

**7. 沉默AF Phe-module枢纽基因改变抗缺血效应**
建立AC16心肌细胞缺氧复氧（H/R）模型，DHI干预后细胞活力显著提升。通过腺病毒介导的RNAi沉默Mod_29的枢纽基因BCMO1和GALR1，Western blotting结果显示：与H/R组相比，H/R+DHI组BCMO1蛋白表达降低、GALR1表达升高；沉默BCMO1后，BCMO1蛋白表达在shRNA1+H/R组较空病毒组降低，但DHI干预后进一步降低；沉默GALR1后，GALR1蛋白在shRNA1+H/R组较空病毒组升高，但shRNA1+DHI+H/R组较shRNA1+H/R组降低。表明BCMO1和GALR1是DHI抗缺血效应的多靶点。

**总结与讨论**

本研究提出的MoPheWAS框架有效揭示了DHI治疗SAP的32个On-module多靶点和14个Phe-modules，系统关联11个临床表型。其中，Mod_24、Mod_27、Mod_29、Mod_32等Phe-modules及其枢纽基因GALR1、BCMO1、TSPAN、ANGPTL2涉及GPCR信号、蛋白激酶结合和血管生成。模块调控因子与多态性表型关联的景观阐明了SAP治疗异质性背后的多靶点机制。讨论部分指出，单靶点策略难以解释多靶点药物的综合疗效，模块化重连比单基因更能反映整合应答；MoPheWAS拓展了传统PheWAS从SNP/基因到多基因模块的分析维度，为其他复杂疾病的精准医学提供了表型特异性多靶点识别模板。研究局限性包括：临床表型有限、样本量中等、模块-表型相关可能存在过拟合，需进一步实验验证。结论：MoPheWAS有效揭示了32个On-module多靶点和14个Phe-modules系统关联11个SAP临床表型；Phe-modules（Mod_24、Mod_27、Mod_29、Mod_32）及枢纽基因（GALR1、BCMO1、TSPAN、ANGPTL2）涉及GPCR信号、蛋白激酶结合和血管生成；模块调控因子与多态性表型关联的景观揭示了SAP治疗异质性背后的多靶点机制；因此，MoPheWAS可能为其他疾病的多表型靶点识别提供新的系统性范式。