《Conservation Genetics Resources》：Partial SRY gene sequences of the endangered volcano rabbit (Romerolagus diazi) and the eastern cottontail rabbit (Sylvilagus floridanus) as Y-linked molecular resources for leporid conservation genetics
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兔科动物通过促进种子传播和作为多种捕食者的猎物，在生态系统中发挥重要作用。然而，多种兔科物种正受到栖息地退化的威胁，这凸显了对能够支持野生和圈养种群研究的遗传资源的需求。SRY基因位于大多数雄性哺乳动物的Y染色体上，是父系谱系研究的有用标记，并可能提供与保护遗
兔科动物通过促进种子传播和作为多种捕食者的猎物，在生态系统中发挥重要作用。然而，多种兔科物种正受到栖息地退化的威胁，这凸显了对能够支持野生和圈养种群研究的遗传资源的需求。SRY基因位于大多数雄性哺乳动物的Y染色体上，是父系谱系研究的有用标记，并可能提供与保护遗传学相关的信息。在本研究中，研究人员从14只雄性兔科动物中获得了部分性别决定区Y（SRY）序列：12只由动物园管理的Romerolagus diazi、一具野生R. diazi尸体和一具野生Sylvilagus floridanus尸体。获得了三个独特的共有序列并存入GenBank：PV612454和PV612455对应R. diazi，PV612456对应S. floridanus。分析片段包含R. diazi的703个碱基对（bp）和S. floridanus的741 bp，包括约173 bp的5′调控区和一个部分转录单元，覆盖前176个密码子，含高迁移率族蛋白盒（HMG-box）结构域；未恢复完整的SRY编码区。与现有兔科SRY序列的比较显示，调控区的鸟嘌呤-胞嘧啶（GC）含量低于转录单元，而R. diazi和S. floridanus在调控区和3′ SRY区域表现出相对较高的GC值。在调控区和编码区检测到多态性位点，氨基酸变异集中在保守的高迁移率族蛋白盒结构域之外。基于距离的单基因座比较为所分析的兔科序列提供了初步的父系谱系框架。
**一、研究背景、问题与研究目的**
兔科动物（Leporidae）包括兔和野兔，在生态系统中扮演重要角色，通过种子传播和作为捕食者的食物来源维持生态平衡。墨西哥拥有美洲最高多样性的兔科动物，共15种，其中东部棉尾兔（*Sylvilagus floridanus*）和火山兔（*Romerolagus diazi*）是代表性物种。东部棉尾兔分布广泛，被列为无危物种；而火山兔（又名teporingo或zacatuche）是小型夜行性兔科动物，栖息于墨西哥中部高海拔的温带草地，目前分布范围极局限（约386.5 km2），被墨西哥官方和世界自然保护联盟（IUCN）列为濒危物种。火山兔面临栖息地丧失、农业扩张、非法伐木和气候变化等多重威胁，其脆弱性因适应高山生态系统而加剧。然而，现有保护措施不足，亟需遗传工具支持种群结构评估、父系谱系监测和遗传多样性研究。
SRY基因（性别决定区Y基因）位于Y染色体上，是雄性哺乳动物胚胎性分化启动的关键基因，编码约204个氨基酸的DNA结合蛋白（含高迁移率族蛋白盒（HMG-box）结构域）。该基因无内含子，通过父系遗传，是父系谱系研究的有效标记，可用于鉴定父系单倍型、监测Y连锁变异，并辅助性别鉴定分子工具的开发。然而，兔科动物中Y染色体连锁序列资源稀缺，尤其对于火山兔等特有和濒危类群。因此，本研究旨在为火山兔和东部棉尾兔生成部分SRY基因序列，包括5′调控区和部分编码区（含HMG-box），并比较现有兔科SRY序列，评估保守性和变异，为后续父系谱系研究、比较遗传学和保护遗传学提供初步的Y连锁分子资源。
**二、主要关键技术方法**
1. **样本来源**：从墨西哥城查普尔特佩克动物园和科约阿坎动物园获取12只圈养雄性火山兔的耳组织样本；从奇奇纳乌钦生物走廊的Tlaloc火山山坡收集一具野生火山兔尸体；从伊兹塔-波波国家公园获取一具野生东部棉尾兔尸体。所有样本均为常规管理或死后获取，无动物因本研究被捕获或处理。
2. **DNA提取、PCR扩增与测序**：使用DNeasy Blood and Tissue Kit（QIAGEN）提取DNA；基于家兔（*Oryctolagus cuniculus*）SRY序列（GenBank AY785433）设计引物（Rdiazi-F和Rdiazi-R），扩增约700 bp的5′调控区和部分SRY编码区。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，使用QIAquick Gel Extraction Kit回收，随后进行双向Sanger测序（BigDye Terminator v3.1，ABI 3130测序仪）。序列峰图在MEGA 11中检查，组装共有序列，获得3个独特共有序列（GenBank：PV612454、PV612455、PV612456）。
3. **序列分析**：从GenBank检索现有兔科SRY序列（BLASTN 2.6.1，100%覆盖度），用MUSCLE在MEGA 11中进行比对；计算调控区（RS）和转录/编码单元（TU）的GC含量，识别多态性位点、插入缺失和氨基酸替换；使用DnaSP v5进行滑动窗口分析（1,000次模拟）鉴定HMG-box内的保守区域；采用MAFFT v7.505和IQ-TREE2 v2.0.7进行最大似然（ML）分析（K2P模型，1,000次超快自举和SH-like近似似然比检验），构建无根树。
**三、研究结果**
**Result 1: Sequence characteristics and GC content**
通过分析，火山兔和东部棉尾兔的SRY序列包含约173 bp的调控区和约529–572 bp的转录单元（覆盖前176个密码子，含完整HMG-box的65个氨基酸），约占编码区的86.3%。GC含量在调控区最低（~42%），转录单元较高（~52%）。火山兔（包括圈养和野生个体）和东部棉尾兔在调控区和3′ SRY区域表现出高于平均水平的GC值，尤其在3′ SRY区域偏离最大（+2.00至+2.51个百分点），而HMG-box区域GC值略低于平均水平。
**Result 2: Nucleotide and amino acid polymorphisms**
在调控区检测到多态性位点，包括火山兔共享的4个核苷酸插入（TTCT，位于?30至?27位点），以及与其他兔科物种的多种替换。转录单元中，多态性位点分布于编码区各处，包括HMG-box前后区域。氨基酸变异集中在N端结构域和C端结构域，HMG-box内高度保守，仅火山兔在HMG-box内第52位点为亮氨酸（Leu），而其他兔科动物为其他氨基酸。野生火山兔与圈养火山兔共有序列在少数氨基酸位点（如52和104位）存在差异。这些变异被解释为种间序列差异，而非种群内遗传多样性。
**Result 3: Sequence divergence and sliding-window analysis**
Kimura 2-参数（K2P）校正的核苷酸分歧度在调控区（πK2 = 0.078 ± 0.013）高于转录单元（πK2 = 0.033 ± 0.005），整体片段为πK2 = 0.044 ± 0.005。转换/颠换偏差在调控区为R = 0.90，转录单元为R = 1.57。HMG-box内K2P分歧度为πK2 = 0.0202 ± 0.0066。滑动窗口分析识别出HMG-box内三个保守区域（58 bp、32 bp和40 bp），核苷酸变异显著减少。
**Result 4: Phylogenetic clustering**
无根最大似然树显示，两个火山兔序列形成强支持分支（超快自举和SH-like支持值高）；*Lepus*属序列聚为一组，但内部关系短分支；东部棉尾兔和家兔位于火山兔和*Lepus*分支之外。该分析支持火山兔SRY单倍型与其他兔科序列的区分，但应被解释为父系SRY谱系的单基因座聚类，而非确切的物种系统发育。
**四、讨论与结论**
**讨论**：GC含量在调控区低于转录单元，符合一般规律（调控区GC < 50%常与细胞特异性表达相关）。火山兔和东部棉尾兔在调控区和3′ SRY区域的高GC值可能反映演化差异，但需进一步功能验证。调控区多态性（包括火山兔的4 bp插入和TATA相关区域变异）支持该区域快速演化，但未进行启动子活性实验，功能后果未知。HMG-box高度保守，符合其DNA结合功能，而N端和C端区域变异较大，与哺乳动物中非HMG区域保守性低的报道一致。父系谱系分析中，12只圈养火山兔共享相同SRY序列，可能与圈养群体有限创始来源有关，但野生样本量小，无法推断自然遗传变异。本研究未进行性别鉴定验证（无雌性样本），因此引物不可作为性别诊断工具。
**结论**：为火山兔和东部棉尾兔生成的部分SRY序列扩展了兔科保护遗传学中可用的Y连锁分子资源，可能支持未来父系谱系鉴定、Y连锁单倍型监测和保护导向分子工具的开发。但由于本研究基于单个父系基因座的部分序列和有限野生采样，结果不应被解释为种群结构、基因流或确切的物种级系统发育。未来研究需包括更广泛的野生采样、经确认的雄性和雌性个体，以及互补的线粒体、常染色体或基因组标记，以评估该SRY资源的保护和诊断效用。
