通过单细胞RNA测序鉴定耳蜗中表达pendrin的细胞中Slc26a4的一个新型异构体

《Human Genetics》：Identification of a novel isoform of Slc26a4 by single-cell RNA-sequencing of pendrin-expressing cells in the cochlea

　　

SLC26A4基因的致病性变异导致Pendred综合征（PDS）和非综合征性前庭水管扩大（NSEVA/DFNB4），两者均为常染色体隐性遗传病。前者约占人类遗传性听力损失的6%，使其成为仅次于Usher综合征的第二常见综合征性耳聋类型，而后者是与儿童感音神经性听力损失（SNHL）相关的最常见放射学畸形。在本研究中，研究人员利用短读长和长读长单细胞RNA测序（scRNA-seq）对小鼠耳蜗中表达pendrin的细胞进行分析，鉴定了一个新的Slc26a4短异构体。研究人员证明了该短Slc26a4异构体在内耳和肾脏中均有表达，并研究了其相互作用和功能。研究人员还基于这两种异构体表征了SLC26A4相关听力损失的基因型-表型关联。这些结果为pendrin的分子谱提供了新参考，并为细胞类型特异性剪接事件和SLC26A4相关听力损失提供了新见解。

**研究背景与问题**
SLC26A4基因的致病性变异是导致Pendred综合征（PDS）和非综合征性前庭水管扩大（NSEVA/DFNB4）的主要遗传原因，两者均为常染色体隐性遗传病。PDS约占人类遗传性听力损失的6%，是仅次于Usher综合征的第二常见综合征性耳聋；NSEVA则是与儿童感音神经性听力损失（SNHL）相关的最常见骨迷路结构畸形。Slc26a4编码的蛋白pendrin是HCO₃^?/Cl^?反向转运体，通过分泌HCO₃^?调节内淋巴pH稳态。在内耳中，pendrin表达于内淋巴囊、椭圆囊以及耳蜗外侧壁的纺锤细胞（SC）和根细胞（RC）中。这些细胞在成年小鼠膜迷路中数量稀少（约18,000个），使得对其详细研究极具挑战性。为克服这一困难，研究人员采用手动单细胞选择结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）的策略，以获取高质量细胞用于下游分析。

**研究内容与结论**
研究人员利用短读长（Illumina）和长读长（Nanopore）单细胞RNA测序对小鼠耳蜗中表达pendrin的细胞（PDCs）进行分析，鉴定了一个新的Slc26a4短异构体。该异构体由外显子11-21编码，起始于长异构体第432位氨基酸，具有3个跨膜结构域和一个STAS结构域（Sulfate Transporter and Anti-Sigma factor antagonist domain）。在6个SC中，3个仅表达长异构体；在5个RC中，3个仅表达短异构体，提示细胞类型特异性表达。Western blot和免疫荧光实验证实了两种异构体在耳蜗和肾脏中的蛋白表达。共沉淀实验表明，短异构体可形成同源二聚体，也可能与长异构体形成异源二聚体，但异源二聚体稳定性较低。HCO₃^?/Cl^?反向转运实验显示，短异构体无转运活性，且对长异构体的转运功能无调节作用。基于gnomAD和患者数据库的基因型-表型分析发现，位于外显子11-21（影响两个异构体）的致病/可能致病变异的总等位基因计数（TAC）显著低于外显子1-10（仅影响长异构体），但携带两个外显子11-21变异的患者纯音平均听阈（PTA）和低频阈值显著更高，提示短异构体可能参与听觉功能。该论文发表在《Human Genetics》。

**主要关键技术方法**
研究人员使用手动显微操作分离单个pendrin表达细胞，结合SMART-Seq2方案制备全长cDNA，并行进行Illumina短读长和Nanopore长读长测序。通过Mandalorion管道分析异构体多样性，并利用Kozak序列分析、Western blot、免疫荧光、共沉淀实验和HCO₃^?/Cl^?反向转运实验验证异构体表达与功能。样本来源包括1月龄野生型（WT）和Slc26a4^?/?小鼠（129S6背景），以及来自MORL患者数据库和文献的听力图数据。

**研究结果**
- **两种单细胞RNA-seq文库的基因表达定量**：两种测序技术共同鉴定出平均2857个基因，平均转录本长度约50,000 bp。
- **Illumina短读长和Nanopore长读长scRNA-seq揭示Slc26a4的新转录起始位点**：在外显子10和11之间发现一个新的5′非翻译区（UTR），该区域在RefSeq中无注释。翻译起始于外显子11的甲硫氨酸密码子，形成短异构体。Kozak序列在人和小鼠的长、短异构体中均保守。
- **长、短pendrin异构体的结构与表达**：长异构体含21个外显子，编码780个氨基酸；短异构体含11个外显子，编码349个氨基酸，预测有3个跨膜结构域。scRNA-seq显示，SC中3/6仅表达长异构体，RC中3/5仅表达短异构体，且短异构体在RC中表达水平更高。Western blot在耳蜗和肾脏中检测到两种异构体（110 kDa和39 kDa）。免疫荧光证实RC中C端抗体标记更强，提示短异构体在RC中富集。
- **长、短pendrin异构体的相互作用**：共沉淀实验表明，短异构体可形成同源二聚体，也能与长异构体形成异源二聚体，但异源二聚体稳定性较低。
- **长、短pendrin异构体的HCO₃^?/Cl^?反向转运实验**：短异构体无Dox依赖性转运活性，且蛋白表达量低，可能由于结构不稳定。在共表达长异构体的细胞中，短异构体对长异构体的转运活性无调节作用。
- **基于异构体的基因型-表型关联**：gnomAD数据显示，外显子1-10的致病/可能致病变异总等位基因计数（TAC）为1109（78%），外显子11-21为316（22%）。在MORL数据库中，133例患者中74%的变异位于外显子1-10。按变异位置分组分析听力图，携带两个外显子11-21变异的患者（Group 1）PTA和低频阈值显著高于携带两个外显子1-10变异的患者（Group 2），表明影响两个异构体的变异导致更严重的听力损失。

**讨论与结论**
讨论部分指出，研究鉴定了pendrin的一个新型短异构体，其缺乏反向转运体功能，但可能通过与其他蛋白（如IQGAP1、CA13）相互作用参与听觉功能。基因型-表型数据支持短异构体具有独立于长异构体的生物学作用。研究局限性在于细胞数量少和未能明确短异构体的具体功能。结论：研究人员发现了一个新的pendrin短异构体，其不具备经典长异构体的反向转运体功能，但基于表型-基因型关联，可能对听觉功能有贡献。建议构建异构体特异性小鼠模型以明确两种异构体在听力和耳聋中的角色，这将为理解pendrin的功能复杂性提供新见解。