小鼠中生物钟蛋白Period 1的缺失会引发性别差异性的动脉硬化及肥厚性重塑

《Journal of the American Heart Association》：Loss of the Circadian Clock Protein Period 1 Mediates Sex‐Dependent Increase in Arterial Stiffness and Hypertrophic Remodeling in Mice

　　

动脉僵硬度增加是多种心血管疾病发病及进展的重要因素。动脉僵硬度升高可作为血管老化的指标，而作为其无创临床检测指标的脉波速度改善，则与接受透析的终末期肾病患者生存率提高相关。¹虽然传统上认为动脉僵硬度增加是长期高血压的结果，但如今越来越多的研究认为，动脉僵硬度升高往往先于高血压出现，并且本身也是导致血管疾病的独立因素。²因此，研究动脉僵硬度异常升高的分子机制，对于设计针对性干预措施以阻止或逆转其进展至关重要。

生物钟是一种内在机制，可调控大多数生物体的各种生理功能和行为，使其适应昼夜循环。长期的生物钟紊乱（如不规律的睡眠和饮食习惯、慢性时差反应以及压力）可能导致体内生物钟失调，从而显著增加患心力衰竭、高血压和中风等疾病的风险。PER1蛋白是分子生物钟的核心组成部分，几乎在身体的所有器官中都有表达，包括血管系统。我们团队 Recent的研究表明，完全删除PER1基因会导致雄性啮齿动物出现盐敏感型高血压³，但雌性啮齿动物则不会出现这种情况⁴。此外，仅在肾脏中删除PER1基因也会导致肾脏对钠的处理能力出现性别差异，同时血压会有轻微上升，这表明肾脏外的PER1功能对于高血压的发生至关重要⁵。不过PER1在血管系统中的作用，尤其是在动脉僵硬度升高机制中的作用，目前仍不清楚。因此，本研究旨在探讨PER1缺失是否会导致小鼠的动脉僵硬度、结构及功能出现性别差异。

本研究的相关数据可向通讯作者索取。本研究使用了在家培育的16–18周龄C57BL/6J品系雄性和雌性小鼠，其中一部分为PER1基因完全敲除组，另一部分为野生型组。这些小鼠被饲养在温度控制在22℃–25℃、光照与黑暗周期为12:12的实验室环境中。所有实验均获得了佛罗里达大学以及北佛罗里达/南乔治亚州退伍军人管理局动物护理与使用委员会的批准。所有小鼠都接受了超声心动图检测，以测量脉波速度从而评估主动脉的僵硬度（雄性：n=10；雌性：n=5）。此外，还对雄性小鼠进行了线张力测定，以评估其第三级肠系膜小阻力动脉的功能特性（n=5）。从雄性小鼠身上采集的主动脉组织经过快速冷冻后，通过Sircol检测法以及液相色谱-质谱技术分析了其中的胶原蛋白含量及其交联程度（n=5–8）。所有的功能检测和组织采样都在上午11点至下午2点之间进行。组间比较采用了带重复测量的双因素方差分析以及精确的两样本Fisher–Pitman排列检验，P值小于0.05被视为具有显著性意义。

与同年龄段的野生型对照组相比，PER1基因缺失的雄性小鼠的脉波速度明显升高（野生型：202±8.3 cm/s，PER1敲除组：286.9±27.38 cm/s，P=0.005），而雌性小鼠则没有这种变化（野生型：219±14.2 cm/s，PER1敲除组：225.9±23.1 cm/s，P=0.817）（见图AA和图BB）。基于这一结果，后续实验仅在雄性小鼠中进行。对主动脉组织的形态学分析显示，PER1敲除组小鼠的主动脉外膜厚度明显增加，增加了30%（P=0.028）（见图CC至图EE）。在线张力测定实验中，所有组别的血管在苯肾上腺素浓度升高时都会出现典型的S形张力上升曲线。不过PER1敲除组小鼠对苯肾上腺素的最大收缩反应明显弱于野生型小鼠（最大收缩反应：野生型：54.2±7 mN，PER1敲除组：39.44±3.9 mN，P<0.001）（见图FF）。此外，PER1敲除组小鼠中苯肾上腺素的效应强度也发生了变化，用pEC-50表示时，野生型的值为432.5±12 nM，而PER1敲除组的值为644.6±9 nM，P<0.001）（见图FF），这说明PER1敲除组小鼠对α1-肾上腺素受体的敏感性降低。PER1敲除组小鼠对硝普钠的最大舒张反应也明显减弱（最大舒张反应：野生型：85.7±10.4%，PER1敲除组：56.91±7.01%，P<0.001）（见图GG）。同样，在经苯肾上腺素预收缩的血管中，PER1敲除组小鼠对乙酰胆碱的血管舒张反应也出现异常（P<0.001，见图HH），这说明PER1敲除组小鼠可能存在内皮功能障碍。进一步研究还发现，PER1敲除的雄性小鼠的不可溶性胶原蛋白、可溶性胶原蛋白以及总胶原蛋白含量均明显高于野生型小鼠（不可溶性胶原蛋白：P=0.050，见图II；可溶性胶原蛋白：P<0.039，见图JJ；总胶原蛋白：P<0.040，见图KK）。不过，PER1敲除组小鼠与野生型小鼠的脱氧吡啶啉类和吡啶啉类交联胶原蛋白含量没有差异（脱氧吡啶啉类：P=0.873，吡啶啉类：P=0.058，分别见图LL和图MM）。最后，PER1敲除组小鼠的主动脉羟脯氨酸含量也明显升高（P<0.032），这表明其主动脉存在纤维化现象（见图NN）。

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图1。完全删除生物钟蛋白PER1会增加主动脉僵硬度并引发肥大性重构。

A，野生型及PER1基因敲除的雄性小鼠（实心圆，n=10）和雌性小鼠（空心圆，n=5）的主动脉脉波速度累计数据，可见PER1基因敲除的雄性小鼠主动脉僵硬度更高（B）。用苏木精-伊红染色处理后的主动脉组织图像，显示PER1基因敲除组小鼠的主动脉外膜厚度明显高于野生型雄性小鼠（D，对比C）。E，从雄性小鼠的主动脉切片中测得的主动脉外膜厚度累计数据（n=4）。F，从野生型及PER1基因敲除的雄性小鼠（各n=5）分离出的第三级肠系膜动脉段对苯肾上腺素的剂量-反应性收缩曲线。G，PER1基因敲除组与野生型雄性小鼠的经苯肾上腺素预收缩的肠系膜动脉段对硝普钠的血管舒张反应。H，PER1基因敲除组与野生型雄性小鼠的经苯肾上腺素预收缩的肠系膜动脉段对乙酰胆碱的血管舒张反应，舒张程度以相对预收缩水平的百分比表示。对从雄性小鼠身上采集的主动脉中的不可溶性胶原蛋白（I）、可溶性胶原蛋白（J）及总胶原蛋白（K）进行了Sircol检测分析（n=5）。还通过液相色谱-质谱技术分析了雄性小鼠主动脉中的吡啶啉类物质（L）和脱氧吡啶啉类物质（M，n=6–8）。N，通过比色法测定雄性小鼠主动脉组织中的羟脯氨酸含量（n=7）。图表数据是通过精确的两样本Fisher–Pitman排列检验进行分析的。线张力测定数据的组间比较则采用了带重复测量的双因素方差分析。数据以均值±标准误的形式呈现，P值小于0.05视为具有显著性意义。Ach表示乙酰胆碱；CTL表示对照组；DPD表示脱氧吡啶啉；KO表示基因敲除；PE表示苯肾上腺素；PER1表示周期生物钟蛋白1；PWV表示脉波速度；PYD表示吡啶啉；SNP表示硝普钠；WT表示野生型。

动脉僵硬度的形成机制十分复杂且受多种因素影响。生物钟可调控动脉的弹性，而生物钟紊乱则会降低动脉的弹性和顺应性。我们的研究结果表明，PER1基因的缺失会导致雄性小鼠的主动脉僵硬度升高，但雌性小鼠则不会，这表明PER1在动脉僵硬度形成过程中存在性别特异性作用。从机制上来看，这些结果支持这样一种假设：PER1基因的缺失会改变调控血管平滑肌收缩功能及一氧化氮信号通路的基因表达，进而导致血管舒张功能受损，动脉僵硬度升高。总体而言，PER1通过调控细胞外基质的重构以及血管张力，对维持血管稳态起着关键作用。未来有必要利用针对特定血管的基因敲除模型，进一步明确PER1在调控血管张力、内皮功能以及血压节律方面的直接作用。

资金来源

本研究得到了美国心脏协会24SCEFIA1253690项目（资助对象为Ravinda K. Sharma）、美国国家心肺血液研究所K08HL130945项目（资助对象为Rajesh Mohandas）以及美国国立卫生研究院1R01DK109570‐01A1项目（资助对象为Michelle L. Gumz）的支持。