《Journal of the American Heart Association》：Shear Difference: Flow Type Dictates Endothelial Flow‐Responsive Gene Programs in a 3‐Dimensional–Printed In Vitro Model
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背景：内皮细胞（Endothelial cells, ECs）具有机械敏感性，并在血流动力学作用力下采取不同表型。这些响应在传统体外平台中难以研究，因其很少能重现血管尺度几何结构或临床相关流动。研究人员旨在确定在三维宏流体模型中流动如何影响内皮形态与转录活性。
背景：内皮细胞（Endothelial cells, ECs）具有机械敏感性，并在血流动力学作用力下采取不同表型。这些响应在传统体外平台中难以研究，因其很少能重现血管尺度几何结构或临床相关流动。研究人员旨在确定在三维宏流体模型中流动如何影响内皮形态与转录活性。方法：使用水溶性聚乙烯醇（Polyvinyl Alcohol, PVA）三维打印理想化血管并以聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane, PDMS）浇铸。核心溶解后，在人微血管内皮细胞系?1（Human Microvascular Endothelial Cell Line?1, HMEC?1）细胞于管腔内生长，并在静态、连续流或脉动流下灌注24小时。脉动波形源自动静脉瘘多普勒剖面并按平均体积流量（~100 mL/min）和时间平均壁面剪应力（Time?Averaged Wall Shear Stress, ~1.5 dyn/cm2）缩放以匹配连续流。使用免疫荧光评估形态。进行批量RNA测序（Bulk RNA?Sequencing）与基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis）。结果：相对于静态培养，连续流增加细胞偏心度（0.74 对 0.48；P<0.0001）并降低取向变异性（Δ=?47.1°，P<0.0001）。差异基因表达广泛（连续流对静态：2103个基因；脉动流对静态：2643个基因；脉动流对连续流：384个基因）。连续流相对于静态降低干扰素信号与Hallmark炎症反应程序，而肿瘤坏死因子?α（Tumor Necrosis Factor?α, TNF?α）/核因子?κ?轻链增强子活化B细胞（Nuclear Factor?κ–Light?Chain Enhancer of Activated B Cells, NF?κB）信号增加。在匹配平均剪应力下，脉动流富集细胞周期/检查点程序；相反，连续流富集氧化磷酸化与p53通路。转化生长因子?β（Transforming Growth Factor?β, TGF?β）信号在脉动流中富集。结论：在匹配平均剪应力下，脉动流与连续流与不同的内皮形态及转录特征相关。该宏流体平台为机制与转化研究提供了经过验证、波形可控的试验台。
该研究发表于《Journal of the American Heart Association》。研究背景方面，内皮细胞形成覆盖约350 m2成人血管的连续单层代谢活性界面，作为生化传感器与机械转导器整合循环信号与血流动力学力，调节抗凝、抗血栓及血管活性输出。血管壁面剪应力是主导的内皮刺激，其与粘度、体积流量及管腔半径相关，微小几何变化可致局部壁面剪应力大幅改变并显著影响内皮表型。内皮机械感知依赖整合素、受体酪氨酸激酶、G蛋白偶联受体、离子通道及细胞间连接蛋白等启动下游信号，流场大小与模式影响生物学状态：稳态层流壁面剪应力激活脂质信号与激酶级联至内皮型一氧化氮合酶产生一氧化氮介导血管舒张并抑制炎症；振荡壁面剪应力增加核因子?κ?轻链增强子活化B细胞表达并促进促黏附、促凝血、促炎表型。传统二维细胞培养将内皮细胞约束于刚性平面，缺乏生理曲率与真实血流动力学，导致形态、连接、增殖、分化、代谢及药理响应与体内状态偏离；三维培养虽更好重现体内形态与转录组，但常无法重现生理剪应力。高精度成像与增材制造可捕捉患者特异性几何与血管曲率、锥度及分支，在此类打印构件上于受控血流环境中培养内皮细胞可生成兼具经典体外系统实验控制与体内壁面剪应力几何决定因子的宏流体试验台。因此研究人员旨在开发支持内皮细胞生长并耦合泵系统以实现连续层流或可编程生理相关脉动流灌注的三维打印宏流体平台，表征流动属性对内皮形态与转录组的影响，阐明壁面剪应力与流型在内皮机械转导中的关键作用。
为开展研究，研究人员使用的主要关键技术方法包括：采用商用计算机辅助设计软件设计理想化6 cm血管，筛选可溶性打印丝材并在熔融沉积制造三维打印机上打印，通过温度塔校准与静态水浸进行表面平滑优化；以聚二甲基硅氧烷浇铸并打印芯模溶解获得灌流管腔；使用人微血管内皮细胞系?1细胞在纤连蛋白包被表面静态培养形成单层后接入闭环灌注系统；基于13例动静脉瘘患者多普勒超声数据提取参数并缩放至平均体积流量约100 mL/min以编程生成生理脉动波形，使用可编程蠕动泵与超声流量计控制并监测连续流与脉动流条件各灌注24小时；通过鬼笔环肽与4′,6′?二脒基?2?苯基吲哚染色及共聚焦显微镜进行形态学评估；提取总RNA进行批量RNA测序，使用差异表达分析流程与预排序基因集富集分析进行Hallmark通路富集；采用精确置换检验进行形态学统计推断。
研究结果部分保留原文小标题并依其内容总结如下：
Construction and Characterization of a 3D Macrofluidic System：研究人员通过温度塔筛选确定eSUN PVA具有最稳定挤出与尺寸保真度，30秒静态水浸将表面粗糙度由47.4±14.8 μm降至14.03±0.9 μm且不引入变形；聚二甲基硅氧烷浇铸并溶解PVA后得到打印几何的管腔，10 μg/mL纤连蛋白包被提供最稳健细胞黏附，接种密度3.75×104 cells/cm2静态24小时获汇合内皮单层，活死染色确认存活，肿瘤坏死因子?α刺激显著上调细胞间黏附分子1与血管细胞黏附分子1表达证实功能响应；连续流平均98.85±0.8 mL/min，脉动流基于患者数据平均99.32±5.66 mL/min、周期0.84秒，内径4.8 mm下连续流时间平均壁面剪应力约1.50–1.55 dyn/cm2、雷诺数433–447，脉动流壁面剪应力1.30–1.69 dyn/cm2、雷诺数376–486，连续流脉动指数约0.03，脉动流约0.25，沃默斯利数α≈6.6，振荡剪应力指数为0。
Flow Impacts EC Morphology：研究人员通过免疫荧光定量发现静态培养细胞呈铺石状无优选取向，连续或脉动流24小时后细胞拉长、F?肌动蛋白束沿流线排列；精确置换检验显示平均偏心度整体差异显著，静态最低0.79±0.06，脉动流中间0.91±0.03，连续流最高0.96±0.01，连续流显著高于静态与脉动流，静态与脉动流无显著差异；取向离散度静态最大52.9°±17.7°，连续流9.5°±3.5°与脉动流11.9°±3.1°均显著低于静态，连续与脉动间无显著差异。
Flow Alters Transcription of Shear?Responsive Genes：研究人员对每条件3个独立生物学重复进行批量RNA测序，主成分分析显示静态与流动样本分离及连续与脉动次级分离；连续流对静态显著差异2103个基因，其中856上调、1247下调；脉动流对静态显著差异2643个基因，其中1017上调、1626下调；连续流对静态前50差异基因热图显示流动与静态明显聚类。
Flow Modulates Growth, Stress, and Immune Signaling Programs：研究人员对连续流对静态的Hallmark通路富集显示连续流正富集MYC靶V1、转化生长因子?β信号、MYC靶V2、未折叠蛋白响应、肿瘤坏死因子?α经由核因子?κ?轻链增强子活化B细胞信号、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1信号、上皮?间质转化、UV响应上调，负富集干扰素?γ响应、干扰素?α响应、UV响应下调、胆汁酸代谢、KRAS、过氧化物酶体；脉动流对静态正富集MYC靶V1、MYC靶V2、转化生长因子?β信号、未折叠蛋白响应、肿瘤坏死因子?α经由核因子?κ?轻链增强子活化B细胞、上皮?间质转化、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1信号、G2M检查点、有丝分裂纺锤体，负富集干扰素?α响应、干扰素?γ响应、胆汁酸代谢、雌激素响应晚、脂肪酸代谢、雌激素响应早、脂肪生成、炎症反应、顶端连接。
Flow Pattern Alters Transcription of Shear?Responsive Genes：研究人员在脉动流对连续流直接比较中149基因上调、235基因下调；脉动流正富集有丝分裂纺锤体、UV响应下调、G2M检查点、MYC靶V2、E2F靶、转化生长因子?β信号、上皮?间质转化、顶端连接、MYC靶V1，负富集雌激素响应晚、p53通路、UV响应上调、氧化磷酸化、凝血。
讨论部分总结：研究人员构建的血管模拟三维打印宏流体系统在匹配平均流量、雷诺数与时间平均壁面剪应力下，脉动与连续波形仍关联不同内皮转录状态，形态差异具特征特异性，偏心度有显著差异而取向离散度无差异，表明对内皮细胞对剪应力变化率等特征敏感；两流型相对静态均诱导共享剪响应转录特征如未折叠蛋白响应、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1、上皮?间质转化及MYC靶，但增殖程序分化：连续流相对静态负富集有丝分裂纺锤体与E2F靶，脉动流正富集细胞周期/检查点包括G2M检查点与有丝分裂纺锤体；脉动流对连续比较中脉动流相对富集细胞周期/检查点，连续流相对富集氧化磷酸化与p53通路，转化生长因子?β信号等在脉动流相对富集，表明匹配平均剪应力下波形形状关联细胞周期/检查点与氧化代谢信号的差异侧重；该差异与波形特征而非平均负荷单独决定内皮状态的机械生物学一致，本研究脉动条件为层流无反向、振荡剪应力指数为0，区别于经典振荡/扰动剪应力模型，差异归因于脉动幅度与时间剪应力梯度；此前工作强调波形幅值频率形状，本研究显示在均值、雷诺数、时间平均指标恒定下波形仍关联增殖、代谢、连接组成与炎症基调的通路差异及较温和形态差异，提示内皮细胞对剪应力随时间变化率等流动细微特征敏感，涉及内皮糖萼、整合素、离子通道、连接复合体与YAP?TAZ机械转导器整合；研究使用人微血管内皮细胞系?1且限于低剪应力~1.5 dyn/cm2非反向层流，结论限于此条件，未来需扩展至原代人类动静脉内皮细胞、更高动脉层流剪应力与颈动脉等几何；该三维宏流体平台通过匹配几何与材料顺应性及验证波形可更好保留极化、糖萼完整、连接架构与一氧化氮信号，结合临床影像计算流体动力学可实现患者水平波形与个体化内皮建模与器械药物测试；本研究表明即使单一因素微小改变亦可改变基因表达与表型，强调明确报告波形描述符以确保重复性与外部效度的重要性。
研究结论部分原文翻译：在匹配平均剪应力下，脉动流与连续流与不同的内皮形态及转录特征相关。该宏流体平台为机制与转化研究提供了经过验证、波形可控的试验台。
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