外用活性成分的皮肤生物分布：评估实验室内部与实验室之间的重现性

《International Journal of Pharmaceutics: X》：Cutaneous biodistribution of topically applied active ingredients: Evaluation of intra- and inter-laboratory reproducibility

　　

一种稳健的方法来量化活性成分的空间分布及其随表皮和真皮深度变化的浓度，对于化妆品和医药产品均具有优势。在此，研究人员在有限剂量条件下使用人腹部皮肤（测定了渗透和总沉积量）进行了基于盒式的体外渗透测试(IVPT)（在特定位点），涉及五种理化性质截然不同的物质（亲脂性差异超过350,000倍）。IVPT共使用了十八个皮肤圆盘（面积＝2 cm2，6名女性供体，每名供体3个样本）。随后将其分为三组并分发至欧莱雅操作员1（L1，n＝6）、欧莱雅操作员2（L2，n＝6）和日内瓦大学（UG，n＝6）。随后研究人员使用皮肤生物分布方法(CBM)以高分辨率测定了从角质层到上部真皮层这五种物质的空间分布。从每个圆盘获得二十个厚度为20 μm的皮肤薄层(lamellae)，并量化每个薄层中每种物质的量。研究人员采用一种新颖的统计分析来调查实验室内部（L1对比L2）和实验室之间（L1对比UG以及L2对比UG）生成数据的变异性/重现性。结果表明，在遵循相同方案的情况下，实验室内部和实验室之间的渗透、总沉积和皮肤生物分布数据均无显著差异，并证实了皮肤生物分布方法在理解外用物质在皮肤内处置方面的稳健性。

该研究发表于《International Journal of Pharmaceutics: X》。研究背景方面，目前大多数外用活性药物成分(APIs)旨在穿透角质层(SC)到达活体表皮和真皮靶点并限制全身吸收，化妆品成分靶点亦各异，因此除量化皮肤总沉积外，评估活性成分随渗透深度的空间分布对开发安全有效的制剂至关重要。现有体外渗透测试(IVPT)结合胶带剥离法存在局限，每层角质层剥离量受多种因素影响且难以准确测定，且仅能测量角质层物质量而无法定量活体表皮和真皮内的药物。皮肤生物分布方法(CBM)虽能通过冷冻切片获取不同深度皮肤薄层并定量其中渗透物浓度，但其实验室内部及实验室间的重现性尚需验证。为此，研究人员开展研究旨在评估CBM中冷冻切片步骤的操作者间及场所间重现性，通过单一场所进行IVPT实验、不同操作者进行冷冻切片、统一提取与分析，排除其他变量干扰，验证该方法可靠性。

为开展研究，研究人员使用的主要关键技术方法包括：采用来自6名女性供体的人腹部皮肤样本，经处理制备为厚度约927 μm的皮肤样本并依据OECD测试指南428进行体外渗透测试(IVPT)；应用基于盒式的有限剂量给药方式同时施加五种理化性质差异显著（log₁₀P范围-1.51至4.03）的活性物质；将完成IVPT的皮肤样本冷冻包埋后进行20 μm厚度的连续水平冷冻切片(cryosectioning)以获取20个皮肤薄层(lamellae)；采用超高压液相色谱串联三重四极杆质谱(UHPLC-MS/MS)对各薄层及受体液中的物质进行定量分析；使用R软件进行统计建模，通过Wilcoxon符号秩检验及配对t检验并辅以Bonferroni多重校正，评估实验室内部与实验室间在渗透量、总沉积量及生物分布剖面上的差异。

研究结果如下：

3.1. Analytical methods，研究人员开发的UHPLC-MS/MS分析方法对Proxylane、咖啡因、米诺地尔、化合物X和氧苯酮的定量均显示特异性、敏感性、线性、准确度和精密度，定量上限均为2000 ng/mL，不同物质的定量下限依样本类型（渗透样本或生物分布样本）在0.488至5.16 ng/mL之间，方法符合生物分析FDA指南。

3.2. Evaluation of in vitro skin permeation and total deposition，三名操作者（UG、L1、L2）生成的五种活性物质透皮渗透量与皮肤内总沉积量数据显示，所有配对比较的p值均大于校正后显著性水平（α_c≈0.003）。尽管亲水性物质如Proxylane和咖啡因的总沉积量p值相对较小（0.031），但仍未达显著性差异阈值。结果表明IVPT在各组间具重现性，且在相同协议下总沉积数据在实验室内部（L1对比L2）与实验室之间（L1对比UG、L2对比UG）均无显著差异，支持CBM的重现性。

3.3. Biodistribution profile，CBM生成的五种物质至约400 μm深度的空间分布剖面显示，UG、L1、L2三者轮廓相似。亲脂性最强的氧苯酮（log₁₀P＝4.03）分布较恒定，而亲水性最强的Proxylane（log₁₀P＝-1.51）量随深度急剧下降，符合角质层屏障功能及对亲水性化合物的限制作用。视觉检查与对数转换后分析表明即便使用不同型号冷冻切片机（Microm HM560与CryoStar NX70），数据仍具稳健性。

3.4. Statistical model for the analysis of the biodistribution profiles，对生物分布数据进行自然对数转换后近似服从正态分布，在此基础上进行参数检验。各皮肤薄层（20至360 μm）对数浓度差异的置信区间在校正水平α_c≈0.003下均包含零值；按解剖区域分组（表皮ED 0–80 μm、真皮表皮连接处DEJ 100–200 μm、真皮DM 220–360 μm）后，置信区间在校正水平α_c≈0.001下也均包含零值，无法拒绝零假设，证实三名操作者生成的数据在统计上无显著差异。

讨论部分总结指出，CBM此前已被用于评估和优化新制剂及与上市产品对标，因其能提供表皮和真皮内随位置变化的递送量数据，被认为比IVPT更具生理/药理相关性以建立生物等效性。本研究作为关键第一步，证实了实验室内部与实验室间结果的一致性与重现性。研究人员使用含五种理化性质迥异（亲脂性差异＞350,000倍）活性分子的盒式配方在有限剂量下于人皮肤施药，数据确证熟练操作者能产生一致的皮肤生物分布结果且无统计学显著差异。这推动了该方法的更广泛应用，可提供活性分子（及辅料）在表皮和真皮内空间分布的详细定量信息，促进外用制剂开发并对体内疗效差异提供见解。

研究结论部分翻译：研究人员此前已使用CBM评估和优化新制剂并将其与获批产品进行对标。由于其提供的数据可比较在皮肤内递送的量以及随表皮和真皮位置变化的量，这便是外用皮肤科药物（及护肤产品）的靶区，因此该方法也被提议作为一种比IVPT测试更具生理/药理相关性的体外方法来建立生物等效性。作为上述两项应用的第一步，证明实验室内部与实验室间结果的一致性和重现性至关重要——因而有了本合作研究的动机。使用含有五种化学性质不同、理化性质各异、亲脂性差异超过350,000倍的活性分子并在有限剂量条件下施用于人皮肤的盒式配方所生成的数据，确实证实了熟练操作者能够产生一致的皮肤生物分布结果，且不存在统计学显著差异。这为更广泛地使用该方法打开了大门，该方法可提供有关活性分子（及辅料）在表皮和真皮内空间分布的详细定量信息，并可促进外用制剂的开发，并为理解体内观察到的疗效差异提供见解。