来自两个孤立Bethencourtia palmensis种群的内生真菌：代谢组与生物活性指纹图谱分析

《Pest Management Science》：Endophytic fungi from two isolated Bethencourtia palmensis populations: metabolomic and bioactivity fingerprinting

　　

背景：Bethencourtia palmensis (Nees) Choisy是加那利群岛特有植物，不同岛屿（拉帕尔马岛与特内里费岛）种群含有生物农药化合物，其内生真菌亦显示生物农药生产潜力。本研究探讨取自B. palmensis两岛种群（特内里费岛记为T，拉帕尔马岛记为P）的可培养内生真菌的代谢与生物农药潜力。 结果：两植物种群呈现显著化学轮廓差异：T种群主要成分为11β-acetoxy-5α-(angeloyloxy)silphinen-3-one与tetratriacontane；P种群主要为5α-senecioyloxy-silphinen-3-one、tetratriacontane与jacaranone。从马铃薯葡萄糖琼脂（Potato Dextrose Agar, PDA）培养基中，T与P分别获得21株与16株真菌分离株。乙酸乙酯提取物测试对象为桃蚜（Myzus persicae）、爪哇根结线虫（Meloidogyne javanica）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）与轮枝镰刀菌（Fusarium verticillioides）。T种群3株（14%）具生物活性，属曲霉属（Aspergillus）与青霉属（Penicillium）；P种群13株（81%）具生物活性，属链格孢属（Alternaria）、短梗霉属（Aureobasidium）、曲霉属、青霉属与匍柄霉属（Stemphylium）。使用YES培养基（2%酵母浸膏，15%蔗糖，1.5%琼脂）从P额外分离31株新分离株，其中20株（65%）具生物活性，包括PDA未回收的属。基于气相色谱-质谱（Gas Chromatography–Mass Spectrometry, GC–MS）的代谢物指纹图谱揭示与特定属相关的独特模式。 结论：研究结果凸显B. palmensis两岛种群在植物化学与活性内生真菌方面的显著差异；此外，这些菌株是活性化合物的潜在来源。观察到的广泛生物活性表明其在可持续农业应用的新颖生物农药发现方面具有高潜力。? 2026 作者。《Pest Management Science》由John Wiley & Sons Ltd代表化学工业学会出版。

研究背景方面，内生真菌（endophytic fungi）是在植物组织内生活而不损害宿主的微生物，常赋予植物增强适应性、抗生物与非生物胁迫等益处，是医药、农业与食品工业新生物产品的重要来源，但绝大多数真菌内生菌尚未被研究，全球多样性估计在100万至300万种之间，目前仅正式编目204924种，真正新颖天然产物的发现日益困难。特有植物因其独特植物化学与受限分布，可能携带独特且未被探索的微生物群落，是新颖内生真菌的极具吸引力目标。Bethencourtia palmensis (Nees) Choisy是西班牙加那利群岛特内里费岛与拉帕尔马岛的特有物种，分子分析显示两岛种群存在显著遗传分化，海洋作为自然屏障导致基因流低；尽管形态相似，但环境效应可能导致化学与内生群落组成不同。特内里费岛B. palmensis的化学因含强昆虫拒食效应的silphinene倍半萜而被广泛研究，而拉帕尔马岛的化学尚未研究；其特内里费岛内生真菌区系仅部分探索，两株Aspergillus的代谢潜力已通过抗真菌、杀螨与杀线虫化合物证实，但完整真菌区系未见报道。因此，研究人员分析两岛种群silphinene倍半萜含量定性定量差异，筛选可培养真菌内生菌并评估其产活性提取物（杀虫、杀线虫或抗真菌）能力，通过内部转录间隔区（Internal Transcribed Spacer, ITS）测序进行分类鉴定，并进行比较代谢物指纹图谱以评估内生化学多样性。

关键技术方法方面，研究人员采集加那利群岛特内里费岛Barranco del Río（海拔1400 m）与拉帕尔马岛Taburiente火山口国家公园（海拔约2271–2285 m）开花期B. palmensis地上部分；表面灭菌后于PDA与YES培养基分离内生真菌；选取活性分离株通过改良CTAB法提取DNA，PCR扩增ITS区并Sanger测序进行分子鉴定；分离株于各自液体培养基分批发酵，乙酸乙酯液液萃取制备提取物；植物与真菌提取物以GC–MS分析代谢轮廓；生物测定包括针对桃蚜的拒食活性、爪哇根结线虫的杀线虫测定，以及针对灰葡萄孢孢子萌发抑制与轮枝镰刀菌菌丝生长抑制的抗真菌测定。

结果部分保留小标题并说明如下：

3 RESULTS

3.1 Chemical analysis of the plants：研究人员通过GC–MS分析两岛B. palmensis种群植物提取物，发现化学组成重要差异。T种群主要成分为11β-acetoxy-5α-(angeloyloxy)silphinen-3-one（29.0%）与tetratriacontane（16.0%）；P种群主要为jacaranone（19.8%）、5α-senecioyloxy-silphinen-3-one（37.7%）与tetratriacontane（29.7%），表明两岛种群植物化学轮廓显著不同。

3.2 Endophytic fungal isolates：研究人员从PDA平板获得T种群21株SP分离株，仅3株（14%）具相关生物活性（昆虫与真菌>70%，线虫>90%），鉴定为Aspergillus sp.（SPH2、SPH9，茎来源）与Penicillium sp.（SPH17，叶来源）；P种群16株BP分离株中13株对至少一种靶标有活性（81%），属Alternaria、Aureobasidium、Aspergillus、Penicillium与Stemphylium，其中Alternaria、Aureobasidium与Stemphylium仅在P活性分离株中发现。因P种群生物活性分离株丰富多样，研究人员用YES培养基额外获得31株新分离株，20株（65%）具生物活性；总体PDA获16株活性，YES获20株活性，显示培养基选择性：Alternaria与Aureobasidium偏好PDA，Aspergillus与Stemphylium偏好YES，Penicillium无差异，Cladosporium、Epicoccum、Phoma与Mucor仅在YES获得；发酵产量具菌株依赖性，Aspergillus属如BPT13与SPH9产量较高。

3.3 Chemical profiling of endophytic isolates：研究人员对表1中具生物活性提取物的分离株进行GC–MS分析并按化学轮廓聚类（图3与表S1），活性数据分为活性（>70%）、中等（40–70%）与非活性（<40%）。活性提取物分为5主簇（A–E）与2亚簇（Ef、Eg）及2外群（Ef1、Ef2，Eg1、Eg2），共检测191种不同化合物，87种未鉴定（数据库相似度<80%），占45%潜在未发现化合物；各簇未鉴定化合物比例不同：A（0%）、B（36.6%）、C（21.4%）、D（40.7%）、E（33.6%）。3.3.1 Cluster A：仅Penicillium菌株SPH17，特征为专属产生化合物15（保留时间Retention Time, RT 7.676，penicillic acid），具拒食活性。3.3.2 Cluster B：Cladosporium BPM13与Aspergillus SPH2特征产生化合物25（RT 9.093，mellein，分别占66.6%与32%），具抗真菌（两株）与拒食（BPM13）活性。3.3.3 Cluster C：仅Aureobasidium菌株（BPT1、BPH3、BPH5），特征为化合物15（RT 7.940，massoia lactone平均27.5%）与化合物42（RT 11.622，3,5-dihydroxydecanoic acid δ-lactone平均31.5%），对桃蚜（全部）与灰葡萄孢（BPH5）有活性。3.3.4 Cluster D：以Alternaria为主（BPF6、BPH1、BPT4、BPF4.1、BPF7、BPF5、BPT2），其次Aspergillus（BPG5、BPM7.2、BPM2）、Stemphylium（BPF9、BPF8）与Penicillium（BPH4、BG2），特征为化合物39（RT 11.434，acrylic acid tetradecanyl ester平均6.64%）与化合物129（RT 20.856，oleamide平均27.63%），具抗真菌（所有Alternaria除BPT2，Penicillium BPH4）、杀线虫（Alternaria BPT4、BPF4.1、BPF5、BPT2；Aspergillus BPG5、BPM7.2、BPM2；Stemphylium BPF8）与拒食（Alternaria BPF6、BPF4.1、BPT2；Aspergillus BPG5、BPM7.2、BPM2；Penicillium BPH4、BG2；Mucor BPG3；Stemphylium BPF9）活性。3.3.5 Cluster E：Ef仅Aspergillus分离株（Ef1：BPM5、BPM1、BPM9.2；Ef2：BG6.2、BPM3、BPM7.1），因化合物17（RT 8.026 min，2-(4-hexyl-2,5-dioxofuran-3-yl)acetic acid，Ef1平均3.11% vs Ef2平均17.56%）差异分开，特征为化合物160（RT 25.807 min，3,6-dibenzylpiperazine-2,5-dione平均17.38%），多数对桃蚜（除BPM5）与爪哇根结线虫（除BPM7.1）活性。Eg含Eg1（BPH6、BPT9、SPH9、BPT13、BPT11、BPT3、BPT15）与Eg2（BPF3、BPM4），化学轮廓与生物活性异质；Eg1中Aspergillus BPH6特征为化合物191（RT 37.597 min，stearyl palmitate 28.79%），Stemphylium BPT9为化合物92（RT 16.989 min，oleyl alcohol 21.0%）与化合物67（14.401 min，C15–C19 alkane 15.0%），Aspergillus SPH9与BPT13有化合物38（11.341 min，9-hydroxyhexyl-itaconic acid methyl ester，14.9%与8.0%），BPT13另有化合物10（RT 6.167 min，succinic acid butyl ethyl ester 20.1%），BPT3有化合物67、92（RT 16.989 min，oleyl alcohol 13.5%）、93（RT 17.073，2,4-ditert-butyl-6-(1-phenylethyl)phenol 8.0%），Aureobasidium BPT15有化合物15与42；最活跃为Stemphylium BPT9（所有靶标）、Aspergillus BPH6与SPH9（杀线虫与拒食）、Aspergillus BPT13、Phoma BPT11、Aureobasidium BPT15（抗真菌）与Aspergillus BPT13（拒食）。Eg2为Epicoccum BPF3与Penicillium BPM4，共有差异化合物125（RT 19.608，tributyl acetylcitrate平均22.15%），各自主要化合物为BPF3的化合物162（RT 26.171，squalene 32.05%）与BPM4的化合物23（RT 9.009，4-hydroxyphenylacetic acid 8.19%），分别具拒食与抗真菌活性。基于ITS鉴定与两优势属Aspergillus、Alternaria及其他属化学轮廓，研究人员认为并非所有分离株均为不同菌株，部分可能为同一生物多次分离，如多数Aspergillus（除SPH2、SPH9、BPM7.1）共享拒食与杀线虫模式；Alternaria则无一致模式，可能反映属内不同种或亚种。

讨论部分总结：研究人员观察到两岛B. palmensis种群间明显代谢差异，T提取物以11β-acetoxy-5α-(angeloyloxy)silphinen-3-one为主（曾报道对Leptinotarsa decemlineata有生物活性），P提取物以5α-senecioyloxy-silphinen-3-one、jacaranone（曾在B. hermosae描述，具拒食与细胞毒性）与tetratriacontane（类利他素化合物，促进Trichogramma chilonis与Chrysoperla zastrowi sillemi寄生/捕食活性）为主；两岛遗传分化导致代谢分歧。拉帕尔马岛B. palmensis种群内生真菌分离株生物多样性与生物活性更高；特内里费岛生态更多样、土壤更古老风化，拉帕尔马岛地质更年轻、熔岩流更新，可能宿主不同微生物库；海拔气候变异导致植物微生物组功能转变，宿主基因型驱动微生物分化，宿主代谢组与环境互作影响真菌定殖与菌群组成。本研究强调内生菌筛选对植物保护性状的重要性，BPF3、BPF8、BG3（拉帕尔马）与SPH2、SPH9（特内里费）具生物防治潜力；此前团队曾报道加那利群岛特有植物内生真菌代谢产物在农业的潜力。ITS序列比对仅能到属水平鉴定，因数据库质量与ITS分辨率限制，避免误鉴定；需多分子标记或全基因组测序确认菌株遗传分化。部分分离株属传统致病属（Alternaria、Aspergillus、Aureobasidium等），但与文献内生筛选一致，这些属常见且是次生代谢产物主要生产者，其他较少属（Epicoccum、Penicillium、Stemphylium、Phoma）也有农业活性化合物报道。代谢指纹图谱补充区分相似种化学型并识别产新颖活性代谢物菌株，揭示分类相关分离株间化学分歧，提示同属不同化学型及潜在新化合物，如细菌中亦有类似代谢变异报道。研究人员对各簇鉴定化合物进行文献比对：簇A Penicillium SPH17专属产penicillic acid，有抗微生物、抗真菌及对Pythium aphanidermatum活性；簇B Cladosporium BPM13与Aspergillus SPH2产mellein，有杀螨与抗真菌活性；簇C Aureobasidium产massoia lactone与3,5-dihydroxydecanoic acid δ-lactone，前者有抗真菌活性，后者结构相关；簇D Alternaria主导，特征acrylic acid tetradecanyl ester与oleamide未见生物活性报道，BPF6与BPH1分离且独有未鉴定化合物88（RT 16.328，基峰m/z 181），为潜在新化合物；簇Ef Aspergillus产3,6-dibenzylpiperazine-2,5-dione（报道抗癌增殖，哌嗪衍生物低哺乳毒可作农药）与化合物17（促植物生长、抗Neurospora crassa抗真菌、弱抗菌），但本研究对这些靶标无抗真菌；Eg1中9-hydroxyhexyl-itaconic acid methyl ester为杀线虫剂（专利ES2920198 B2），succinic acid butyl ethyl ester有抗菌，2,4-ditert-butyl-6-(1-phenylethyl)phenol对Cochliomyia hominivorax有抗生育效应；BPT3不同于其他Alternaria，含未鉴定96（RT 17.232，基峰m/z 57）、C34–C36 alkane与β-sitosterol，可能为不同化学型或种；Aureobasidium BPT15与簇C其他株比massoia lactone与3,5-dihydroxydecanoic acid δ-lactone更低，但产更高C22–C36 alkane及2,4-bis(1-phenylethyl)phenol与2,4-bis(dimethylbenzyl)-6-t-butylphenol（报道杀虫抗真菌），支持其为不同化学型；Eg2 Epicoccum BPF3与Penicillium BPM4共有tributyl acetylcitrate（报道抗Curvularia verruculosa），各自主成分squalene（甾醇与前体，有抗革兰氏阳性/阴性菌与念珠菌及类乙酰杀螨潜力）与4-hydroxyphenylacetic acid（报道杀线虫与蚜虫拒食，类似2-hydroxyphenylacetic acid）。

结论部分翻译如下：

本研究揭示了所研究的两个B. palmensis岛屿种群间显著的化学与微生物学差异。拉帕尔马岛种群积累5α-senecioyloxy-silphinen-3-one，而特内里费岛种群产生11β-acetoxy-5α-(angeloyloxy)silphinen-3-one。这些发现支持种群间存在代谢分化，与先前岛屿种群间遗传分化的证据一致。

可培养内生真菌在种群间也存在显著差异。来自拉帕尔马岛的PDA培养物产生了比内里费岛更广泛多样的具生物活性分离株，跨更多属。此外，使用YES培养基从拉帕尔马岛种群额外分离增加了生物活性菌株数量与新属的回收。这凸显采用多样化分离条件对于最大化获取具生物技术潜力的真菌可能是相关的。

分离株发酵提取物的化学指纹图谱显示与特定系统发育群相关的独特代谢物模式，支持优势属内存在不同菌株或化学型。这些结果强化了内生菌筛选对于发现新颖生物活性化合物的价值，并暗示其在可持续农业中发展为生物农药的潜力。未来对最具潜力菌株的发酵条件优化对于提高规模放大生产的产量及鉴定负责所观察生物活性的特定分子至关重要。