《Plant Biotechnology Journal》：RNA-Guided Engineering of the Chloroplast Genome Enabled by Plastid-Expressed Guide RNAs
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研究人员的目的是利用CRISPR/Cas9系统开发叶绿体基因组的RNA引导工程。研究人员设计了叶绿体微基因，以在烟草叶绿体中获得正确大小的单链向导RNA（sgRNA）。sgRNA的5′端由rRNA操纵子启动子的转录定义，其3′端由下游tRNA（trnG）或丁型
研究人员的目的是利用CRISPR/Cas9系统开发叶绿体基因组的RNA引导工程。研究人员设计了叶绿体微基因，以在烟草叶绿体中获得正确大小的单链向导RNA（sgRNA）。sgRNA的5′端由rRNA操纵子启动子的转录定义，其3′端由下游tRNA（trnG）或丁型肝炎病毒（HDV）核酶加工决定。Cas9由核基因表达，并通过与转运肽融合靶向叶绿体。Cas9结合sgRNA并在质体DNA（ptDNA）中引入双链断裂。研究人员在此报告，ndhA和rpoC1基因中的双链DNA断裂通过微同源介导的末端连接（MMEJ）修复，导致ptDNA缺失。研究人员进一步证明，核表达的sgRNA可通过与类病毒RNA融合递送至叶绿体，作为无需直接叶绿体基因组转化即可实现ptDNA RNA引导工程的一种可能方法。这些结果是任何作物中叶绿体基因组RNA引导编辑的第一步。
**论文解读：RNA引导的叶绿体基因组工程**
**研究背景**
叶绿体（质体）基因组工程在烟草（*Nicotiana tabacum*）中需要选择性富集组织培养细胞中的转化质体基因组，每个细胞携带数千个基因组拷贝。传统方法将待插入的DNA（如突变版内源基因或完全外源序列）与选择性壮观霉素抗性标记基因相连，两侧连接与天然质体基因组同源的序列，通过同源重组实现大片段DNA的插入或缺失。该方法适用于壮观霉素选择有效的作物，如马铃薯、番茄、大豆和甜菜。然而，基于CRISPR/Cas9的RNA引导工程在编辑植物细胞器基因组时面临挑战，主要瓶颈是缺乏将单链向导RNA（sgRNA）导入叶绿体的机制。为克服这一限制，研究人员决定直接在质体中生成明确定义的sgRNA。
**研究内容与结论**
研究人员成功实现了烟草叶绿体基因组的RNA引导工程：通过核基因表达Cas9酶并靶向叶绿体，同时在质体基因组中表达正确大小的sgRNA，Cas9与sgRNA结合后在非必需基因*ndhA*和*rpoC1*中引入双链断裂，通过微同源介导的末端连接（MMEJ）修复，导致ptDNA缺失。进一步证明核表达的sgRNA可与类病毒RNA融合递送至叶绿体，实现无需质体转化的RNA引导编辑。该研究首次在作物中实现了叶绿体基因组的RNA引导编辑，为精准编辑系统（如碱基编辑和Prime Editing）在叶绿体中的应用奠定了基础。论文发表在《Plant Biotechnology Journal》。
**关键技术方法**（不超过250字）
研究人员构建了叶绿体sgRNA微基因，使用玉米或烟草rRNA操纵子PEP启动子（Prrn）定义5′端，通过下游tRNA（trnG）或丁型肝炎病毒（HDV）核酶处理定义3′端。Cas9基因经密码子优化并与Rubisco小亚基转运肽融合，通过农杆菌介导转化烟草核基因组。sgRNA微基因通过基因枪法导入质体基因组。利用双抗生素选择（壮观霉素和庆大霉素）筛选同时携带质体微基因和核Cas9基因的植株。通过PCR、Sanger测序、全质体基因组测序鉴定缺失事件。使用共聚焦显微镜验证Cas9-GFP融合蛋白的叶绿体定位。通过小RNA测序分析sgRNA加工。利用茄子潜伏类病毒（ELVd）序列融合sgRNA，通过农杆菌转化核基因组，验证RNA从核向叶绿体的递送。样本来源：烟草品种Petit Havana。
**研究结果**
**2.1 sgRNA基因的设计**
研究人员设计了7个sgRNA微基因，使用不同启动子（rbcL启动子、烟草和玉米rRNA操纵子PEP启动子）和3′端加工元件（tRNA或HDV核酶）。通过基因枪法将微基因插入质体基因组。
**2.2 叶绿体中sgRNA的加工**
通过小RNA测序分析，发现玉米Prrn启动子产生的sgRNA5′端异质性最小，最适用于叶绿体表达。3′端方面，无间隔子的trnG构建体（pAH2）产生正确加工的无附加核苷酸的3′端；HDV核酶自切割效率高，但留下4T接头。
**2.3 Cas9导入叶绿体**
Cas9与GFP融合后，通过共聚焦显微镜证明Rubisco小亚基转运肽能将Cas9蛋白（159 kDa）递送至叶绿体。免疫印迹确认正确大小的融合蛋白。
**2.4 sgRNA引导Cas9切割叶绿体基因组靶位点**
通过杂交（母本携带质体微基因，父本携带核Cas9基因）获得双抗植株。PCR检测到*ndhA*和*rpoC1*基因座的双链断裂修复导致缺失，测序证实缺失由靶位点两侧的微同源序列介导的MMEJ修复。*ndhA*靶位点最常见的缺失为4.2 kb（0.7 kb PCR产物），*rpoC1*靶位点缺失由9-14 nt微同源序列介导。
**2.5 质体基因组中的脱靶突变**
从杂色叶片再生绿色植株，全质体基因组测序显示每个植株仅在*ndhA*靶位点有单一缺失，无脱靶突变。序列覆盖度在靶位点处显著下降，证实缺失事件。
**2.6 ELVd RNA将sgRNA从核靶向叶绿体**
将茄子潜伏类病毒（ELVd）前导序列与靶向*ndhA*的sgRNA融合，通过核表达。在50个独立转化株系中，5个株系PCR检测到0.7 kb缺失片段，证实ELVd RNA可将sgRNA递送至叶绿体并介导切割。但温室中存活植株的ELVd:sgRNA基因发生沉默。
**讨论与结论**
研究人员成功在叶绿体中产生正确大小的sgRNA，并将Cas9转化为核基因编码的叶绿体靶向蛋白。Cas9与叶绿体产生的sgRNA结合后高效切割*ndhA*和*rpoC1*靶位点，双链断裂通过MMEJ修复导致缺失。该方法目前需要为每个sgRNA靶点进行单独的质体转化，限制了设计灵活性和多重能力。从杂色叶片再生的绿色植株已实现缺失的同质体化，且全质体基因组测序未发现脱靶效应。该研究建立了RNA引导叶绿体基因组工程的基础，未来工作将集中于精准编辑系统（碱基编辑和Prime Editing）在叶绿体中的应用，以及通过类病毒RNA序列将sgRNA从核递送至叶绿体，从而适用于仅能进行核转化的作物。ELVd基因在成熟植株中沉默，但在更精细系统中可能有利于在卵细胞中早期编辑后避免持续存在。
**研究结论**：研究人员在此报告从叶绿体微基因成功生产正确大小的sgRNA，并将Cas9转化为植物核基因，通过转运肽靶向叶绿体。核表达的Cas9结合叶绿体产生的sgRNA，高效且特异性地切割*ndhA*和*rpoC1*靶位点，双链断裂通过MMEJ修复，导致ptDNA缺失。携带Cas9/sgRNA的植株叶片出现杂色，从杂色叶片再生的绿色植株已对缺失实现同质体化。全叶绿体基因组测序未发现脱靶效应。此外，通过茄子潜伏类病毒（ELVd）RNA序列将sgRNA从核递送至叶绿体，首次独立证实了RNA递送途径。该结果为RNA引导的叶绿体基因组工程奠定了基础。
