《Journal of Advanced Research》：Biomimetic, self-healing occlusive hydrogel membranes for effective guided bone regeneration
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传统的引导骨再生(GBR)膜存在若干局限性，包括组织粘附不足、机械稳定性有限以及对不规则缺损几何形状适应性差。多糖基生物材料因其生物活性、生物相容性和生物降解性而在牙科护理中发挥重要作用，可作为GBR膜应用。在这项研究中，研究人员开发了一种自修复水凝胶型封闭膜
传统的引导骨再生(GBR)膜存在若干局限性，包括组织粘附不足、机械稳定性有限以及对不规则缺损几何形状适应性差。多糖基生物材料因其生物活性、生物相容性和生物降解性而在牙科护理中发挥重要作用，可作为GBR膜应用。在这项研究中，研究人员开发了一种自修复水凝胶型封闭膜，称为HAPPHy水凝胶，由纳米羟基磷灰石(n-HAp)、聚乙醇(PVA)和苯硼酸共轭透明质酸(HA-PBA)组成，用于引导骨再生(GBR)。为研究水凝胶的粘弹性及自修复和可注射性能，进行了流变学研究。使用改良的搭接剪切试验测量水凝胶的组织粘附性。使用人脐带源干细胞评估水凝胶的成骨细胞诱导作用。在颅骨缺损模型中评估封闭水凝胶膜的骨再生情况。结果表明，该水凝胶表现出与天然牙龈组织相当的机械性能，最小化了刚度失配和伤口裂开风险。体外研究显示良好的生物相容性、骨粘附性、重复机械应力下的持续结构稳定性和成纤维细胞排斥能力。此外，HAPPHy水凝胶在小鼠颅骨缺损模型中维持了缺损覆盖并改善了骨再生。HAPPHy水凝胶显示出良好的理化、机械和生物性能，可能作为引导骨再生(GBR)封闭膜的进一步研究候选者。
该研究发表于《Journal of Advanced Research》。目前牙槽骨缺失是口腔康复中的重大临床挑战，引导骨再生(GBR)虽是有效疗法，但传统GBR膜在屏障功能、机械稳定性、操作适应性、组织整合及吸收特性间存在权衡，非吸收性膜如钛网或与软组织机械不匹配导致伤口裂开，需缝合固定且难以贴合不规则骨缺损；吸收性胶原膜易过早降解丧失屏障完整性，而天然透明质酸(HA)直接用作GBR封闭膜受限于机械稳定性差、组织粘附不足及快速降解，因此需开发兼具HA生物活性与足够机械性能的材料。研究人员开发了由纳米羟基磷灰石(n-HAp)、聚乙醇(PVA)和苯硼酸共轭透明质酸(HA-PBA)组成的自修复可注射粘附性HAPPHy水凝胶，旨在解决现有GBR膜的局限性，评估其作为GBR封闭膜的性能。
作者为开展研究用到的主要关键技术方法包括：通过流变学表征评估水凝胶粘弹性、自修复及可注射性；采用改良搭接剪切试验测量组织粘附性；利用Transwell体系进行细胞毒性、成骨诱导及成纤维细胞阻断评估；借助场发射扫描电镜(SEM)与能谱(EDS)成像材料结构；构建三维快速原型牙槽嵴缺损模型评估填充与抗侵蚀能力；通过牛肋骨微计算机断层扫描(micro-CT)量化移植物留存；在8周龄ICR小鼠皮下植入评估体内生物相容性与稳定性；建立小鼠颅骨缺损模型评估体内骨再生能力；进行苏木精-伊红(H&E)、Masson三色(M-T)及CD31免疫组化(IHC)染色等组织学分析；使用荧光标记生物成像系统监测体内滞留与生物分子保留。样本来源包括人脐带源干细胞、人骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)、NIH-3T3细胞及韩国生物样本库提供的人牙齿与人标本，动物实验经首尔国立大学及OBEN机构动物护理与使用委员会批准。
研究结果如下：
合成与HA-PBA表征。研究人员通过碳二亚胺化学合成苯硼酸共轭透明质酸(HA-PBA)，利用1H NMR、UV-Vis及傅里叶变换红外(FT-IR)光谱确认PBA成功接枝于HA骨架，B-O振动带约1316 cm?1证实共轭。管形成试验显示HA-PBA与未修饰HA均促进人脐静脉内皮细胞(HUVECs)成管，CD44阻断抗体抑制该效应，表明PBA共轭未损害HA的CD44介导血管生成生物活性。
HAPPHy水凝胶制备与表征。将含n-HAp的HA-PBA溶液与PVA混合立即固化形成HAPPHy水凝胶，HA-PBA的PBA基团与PVA二醇形成动态键交联。时间扫描流变显示约50 s发生溶胶-凝胶转变，频率扫描显示1 Hz下储能模量(G′)达29476.6 Pa，接近犬牙龈组织(31107.1 Pa)。SEM显示均匀多孔结构，EDS显示钙分布类似天然牙釉质，具备牙齿仿生特征。
HAPPHy凝胶的自修复性与可注射性。基于PBA-二醇动态键，切割的HAPPHy凝胶10分钟内恢复结构完整性；阶跃应变测试显示500%应变下G′下降，恢复0.5%应变后约10秒恢复约87%模量。通过18G针头挤出后G′无明显变化(12.6±4.7 kPa vs 12.6±4.8 kPa)，具备剪切稀化与注射后结构恢复能力，可贴合不规则缺损。
组织粘附性、抗侵蚀性及成纤维细胞阻断效能。改良搭接剪切试验显示HAPPHy凝胶对皮质骨剥离应力达339.9 mN，松质骨132.4 mN，显著高于胶原膜、HA-PBA/PVA及n-HAp。牛肋骨缺损模型经PBS振荡48小时后micro-CT显示HAPPHy覆盖组移植物体积保留显著优于对照组。Seibert分类三维模型浸没60小时维持外形。Transwell试验显示完全阻断NIH-3T3成纤维细胞迁移，小鼠皮下植入14天组织学显示中央空隙无成纤维细胞侵入，具备屏障功能。
HAPPHy凝胶早期体内滞留与生物分子保留行为。皮下植入FITC-牛血清白蛋白(BSA-FITC)负载凝胶14天，HAPPHy组保留57.40±5.50%重量及明显荧光信号，HA-PBA/PVA组仅33.68±3.81%且无荧光，表明n-HAp提升滞留与生物分子保留能力。流变显示植入14天后G′由24.1±5.7 kPa升至86.1±10.5 kPa，G″由14.5±3.2 kPa升至37.5±2.6 kPa，呈矿物富集网络硬化但未引起不良组织反应。
HAPPHy水凝胶体外生物相容性评估。Transwell共培养24小时钙黄绿素-AM/碘化丙啶(PI)染色未见死细胞，CCK-8显示细胞增殖较对照高33.9%。28天碱性磷酸酶(ALP)染色及定量显示不抑制人脐带间充质干细胞(UCMSCs)成骨分化，支持细胞增殖且不影响成骨。
HAPPHy水凝胶体内生物相容性评估。ICR小鼠皮下植入14天体重无显著变化，植入部位无炎症、纤维化或肿胀，H&E染色未见淋巴细胞浸润及显著组织改变，显示良好体内生物相容性。
小鼠颅骨缺损模型中HAPPHy水凝胶覆盖的体内评估。4 mm直径缺损填充n-HAp并覆盖HAPPHy凝胶45天后，micro-CT显示新生骨体积分数达23.05±3.96%，高于未处理组2.44±0.79%及单纯n-HAp组8.88±1.12%；骨小梁数2.84±0.47 mm?1，骨表面密度10.65±0.80 mm?1均显著提升。H&E与M-T染色显示致密胶原沉积与骨填充，CD31 IHC显示血管数量增多且直径增大，残留水凝胶层维持缺损覆盖与空间隔离。
总结讨论部分：研究人员讨论指出HAPPHy水凝胶通过动态硼酸酯-二醇网络实现自修复与可注射性，解决传统膜裁剪贴合差问题；其骨粘附性源于PBA-钙相互作用及n-HAp仿生矿化，优于胶原膜；抗侵蚀与成纤维细胞阻断维持GBR空间；体内滞留因n-HAp增强网络稳定性，早期模量上升反映聚合物释放与矿物相对富集但未引起软组织排斥；小鼠颅骨模型证实覆盖HAPPHy可促进移植物稳定、血管化及有序骨再生，优于单纯移植物。相较于非吸收性膜需二次取出及软组织刺激、吸收性胶原膜降解可变，HAPPHy在初期数周关键期维持屏障完整，45天仍见残留层，但需在更具临床代表性的GBR模型中与商用膜对照进一步评估降解动力学与长期表现。
结论部分翻译：本研究开发了由n-HAp、PVA和HA-PBA组成的自修复、可注射、粘附性HAPPHy水凝胶。将含n-HAp的HA-PBA与PVA溶液混合后因HA-PBA的PBA基团与PVA二醇的动态连接迅速形成HAPPHy水凝胶。此外，HAPPHy水凝胶在损伤后表现快速结构恢复、对皮质骨与松质骨的粘附、短期体内滞留及良好的体外与体内生物相容性。在小鼠颅骨缺损模型中，HAPPHy水凝胶覆盖有助于移植物留存并与更有序的骨形成相关。因此，HAPPHy水凝胶可能作为GBR封闭膜的进一步临床前研究候选者。
