《Journal of Advanced Research》：Gut microbiota alterations are associated with uterine immune homeostasis via microbiota-metabolite interactions
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摘要：本研究旨在探讨肠道菌群失调与子宫炎症之间的关联，并识别与宿主免疫反应相关的菌群相关因子。研究人员建立了抗生素诱导的失调小鼠模型，随后进行异源移植粪菌(fecal microbiota transplantation, FMT)、微生物补充、代谢物干预及急
摘要：本研究旨在探讨肠道菌群失调与子宫炎症之间的关联，并识别与宿主免疫反应相关的菌群相关因子。研究人员建立了抗生素诱导的失调小鼠模型，随后进行异源移植粪菌(fecal microbiota transplantation, FMT)、微生物补充、代谢物干预及急性大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)攻毒以评估炎症相关结局。研究人员评估了子宫炎症、屏障完整性及免疫反应；分别通过16S rRNA测序和非靶向代谢组学对肠道菌群及粪便代谢物进行谱分析。结果显示，肠道菌群失调与子宫炎症增加相关，表现为细胞因子水平升高、免疫细胞浸润及上皮屏障完整性受损，而FMT部分逆转了这些变化。分类学分析显示，失调期间普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)丰度显著降低，微生物重建后其丰度增加。补充普雷沃氏菌copri(Prevotella copri)与失调小鼠子宫炎症减轻及屏障完整性改善相关。整合微生物组-代谢组分析揭示别孕烷醇酮(allopregnanolone)与普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)丰度呈强相关。失调伴随别孕烷醇酮水平降低，FMT后其水平升高。外源性给予别孕烷醇酮与炎症标志物减少及上皮屏障完整性改善相关。重要的是，肠道菌群失调与大肠杆菌(E. coli)诱导的子宫炎症易感性增加相关，而FMT、普雷沃氏菌copri(Prevotella copri)及别孕烷醇酮(allopregnanolone)与感染相关炎症反应及组织损伤减轻相关。综上，这些发现支持一种菌群-代谢物-宿主相互作用模式，其中普雷沃氏菌copri(Prevotella copri)与宿主相关代谢物别孕烷醇酮(allopregnanolone)共同与子宫免疫稳态相关联。尽管这些结果提供了功能见解，但仍需进一步研究阐明连接肠道菌群与子宫炎症的机制。
研究背景与问题提出
子宫在生殖中发挥核心作用，提供支撑受精、胚胎运输、植入及维持妊娠的高度特化环境。子宫炎症作为子宫常见炎症性疾病，损害子宫内膜容受性及上皮屏障完整性，是人类与动物不孕及植入失败的主要原因。尽管子宫内暴露于大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)等细菌是常见起始因素，但子宫炎症的严重性与持续性常不能仅用局部病原体暴露解释。新兴证据表明系统性免疫与代谢信号显著影响子宫免疫基调，然而调控这些效应的精确网络大多未定义。肠道菌群作为密集且代谢活跃的微生物群落，日益被认为是宿主免疫的核心调节者。失调定义为微生物组成与功能的扰动，已被认为与影响远端器官的炎症性疾病相关。在生殖生物学中，肠道微生物组成与雌激素代谢、排卵障碍、多囊卵巢综合征及妊娠结局相关，提示肠道微生物可对生殖器官生理产生远端效应。然而，肠道微生物扰动是否与子宫炎症反应改变相关仍知之甚少。既往研究多聚焦生殖内分泌疾病、妊娠结局或肠道菌群与生殖生理的组成关联，关于肠道菌群失调是否与子宫炎症易感性改变相关、哪些肠道微生物类群与此过程相连、以及菌群相关代谢物是否反映潜在的肠-子宫免疫相互作用模式尚存重要空白。多数子宫炎症研究聚焦局部细菌感染或生殖道局部菌群，而远端肠道微生物扰动及相关代谢变化的贡献仍未明确定义。为此，研究人员探究肠道菌群失调是否与子宫炎症及大肠杆菌(E. coli)诱导子宫损伤易感性增加相关联，并试图识别与子宫免疫反应相关的代表性微生物类群及菌群相关代谢物。该研究发表于《Journal of Advanced Research》。
主要关键技术方法
研究人员使用无特定病原体级雌性BALB/c小鼠（22–24 g，8周龄）建立抗生素诱导的肠道菌群失调模型，实施异源移植粪菌(fecal microbiota transplantation, FMT)、普雷沃氏菌copri(Prevotella copri)补充、别孕烷醇酮(allopregnanolone)代谢物干预及经宫颈宫内大肠杆菌(E. coli)攻毒建立急性子宫炎症模型。通过16S rRNA基因测序（扩增V3–V4区，Illumina NovaSeq 6000平台）分析粪便微生物组成；采用基于液相色谱-质谱(LC-MS)的非靶向代谢组学分析粪便代谢物并进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集；利用混合组学DIABLO框架整合微生物组-代谢组数据并以Spearman相关分析关联；通过蛋白质定量（Wes自动化毛细管电泳平台检测紧密连接蛋白及MAPK、NF-κB信号磷酸化）、酶联免疫吸附测定(ELISA)检测子宫细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-10）及别孕烷醇酮水平、免疫荧光与免疫组织化学评估HMGB1、HABP2及免疫细胞（Ly-6G?中性粒细胞、F4/80?巨噬细胞）浸润、苏木精-伊红(H&E)染色进行组织病理学评分，以及实时荧光定量PCR(qPCR)分析类固醇生成酶基因(Srd5a1、Akr1c14)表达，综合评估子宫炎症、屏障完整性及组织损伤。
研究结果
Gut microbiota dysbiosis is associated with uterine inflammation and tissue injury
研究人员建立广谱抗生素诱导的失调模型及FMT干预，16S rRNA测序α多样性（ACE、Chao1、Shannon指数）显示失调组微生物丰富度与多样性显著降低，FMT后部分恢复；失调伴随肠道紧密连接蛋白（ZO-1、Claudin-3、Occludin）表达改变及血清脂多糖(LPS)水平升高。子宫组织中，失调与TNF-α、IL-1β、IL-10水平升高及损伤标志物HMGB1、HABP2表达增加相关，肉眼可见子宫红肿，组织学显示黏膜水肿、上皮破坏及中性粒细胞浸润增加，免疫细胞（Ly-6G?、F4/80?）浸润增多，紧密连接蛋白表达降低；FMT干预后上述炎症与损伤指标及组织结构均部分逆转。
Gut microbiota dysbiosis is associated with alterations in microbial composition
对粪便16S rRNA测序的主成分分析(PCA)显示失调组菌群聚类分离，未处理与FMT组聚类接近。分类学水平显示失调组肠杆菌科(Enterobacteriaceae)及梭菌科(Clostridiaceae)相对丰度增加，拟杆菌目(Bacteroidales)尤其是普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)减少，FMT后趋向未处理组；qPCR证实失调组普雷沃氏菌copri(Prevotella copri)丰度显著下降，FMT后回升。
Prevotella copri administration is associated with reduced uterine inflammation and improved barrier integrity under dysbiosis
在失调基础上口服普雷沃氏菌copri(Prevotella copri)干预，结果显示子宫IL-1β、TNF-α降低，IL-10升高，HMGB1与HABP2表达减少，子宫红肿减轻；组织学上皮破坏与炎性浸润改善，免疫细胞浸润减少，子宫紧密连接蛋白（ZO-1、Claudin-3、Occludin）表达上调，表明该菌与失调状态下子宫炎症减轻及屏障完整性改善相关。
Gut microbiota dysbiosis is associated with alterations in fecal metabolite profiles
非靶向代谢组学PCA显示失调组代谢谱分离，FMT与正常组接近；KEGG富集示失调与胆汁分泌、氨基酸代谢相关代谢物增加，ABC转运蛋白、类固醇生物合成、脂质代谢相关代谢物减少。整合分析显示普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)/拟杆菌目(Bacteroidales)与别孕烷醇酮(allopregnanolone)、xyloketal、soyasapogenol A等相关；失调粪便与子宫别孕烷醇酮水平降低，FMT及普雷沃氏菌copri(Prevotella copri)处理后升高，宿主类固醇生成酶基因Srd5a1、Akr1c14表达趋势一致；体外培养普雷沃氏菌copri(Prevotella copri)不产生别孕烷醇酮，但别孕烷醇酮促进其早期生长。
Allopregnanolone treatment is associated with reduced uterine inflammation and barrier disruption under dysbiosis
直肠给予别孕烷醇酮(allopregnanolone)干预失调小鼠，子宫TNF-α、IL-1β、IL-10降低，p38、ERK、p65磷酸化减弱，HMGB1、HABP2减少，子宫充血肿胀减轻；组织学炎性浸润与上皮损伤改善，免疫细胞浸润减少，紧密连接蛋白（ZO-1、Claudin-3、Occludin）表达增加，表明别孕烷醇酮与失调下子宫炎症减轻及屏障破坏缓解相关。
Gut microbiota status is associated with the severity of acute E. Coli-induced uterine inflammation
正常与失调小鼠经宫内大肠杆菌(E. coli)攻毒，感染均致子宫炎症因子升高、HMGB1与HABP2增加、上皮破坏及免疫细胞浸润，失调组更严重；FMT干预后细胞因子、损伤标志物降低，组织结构保留更好，紧密连接蛋白表达部分回升，说明菌群状态与大肠杆菌(E. coli)诱导子宫炎症严重程度相关，FMT与之减轻相关。
Prevotella copri and allopregnanolone are associated with reduced E. Coli-induced uterine inflammation
在抗生素预处理基础上，普雷沃氏菌copri(Prevotella copri)与别孕烷醇酮(allopregnanolone)干预均与大杆菌(E. coli)感染所致子宫TNF-α、IL-1β、IL-10及HMGB1、HABP2降低相关，组织学上皮结构与屏障改善，免疫细胞浸润减少，紧密连接蛋白表达回升；别孕烷醇酮伴p38、ERK、p65磷酸化降低；普雷沃氏菌copri(Prevotella copri)处理子宫大肠杆菌(E. coli)负荷减少，其培养上清抑制大肠杆菌(E. coli)生长（热灭活后消失，pH中和部分改变），表明二者均与大肠杆菌(E. coli)诱导子宫炎症减轻相关。
讨论与结论总结
讨论指出数十年来微生物组研究证实肠道来源信号通过明确器官轴影响远端器官生理，子宫炎症多被视为局部病原体驱动，此局部观点可能掩盖调节子宫免疫基调的系统性贡献者。本研究提供肠道菌群组成、代谢物变化与子宫免疫反应关联的证据，普雷沃氏菌copri(Prevotella copri)与宿主相关代谢物别孕烷醇酮(allopregnanolone)与子宫屏障完整性及炎症相连，将器官特异性菌群轴框架扩展至子宫。结果表明失调与子宫促炎表达及组织损伤相关，FMT恢复微生物稳态大体逆转病理改变，支持菌群相关免疫调节的可塑性；分类学显示失调消耗普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)，补充普雷沃氏菌copri(Prevotella copri)降低促炎因子、上调IL-10、减少损伤蛋白与免疫细胞浸润、恢复上皮屏障，其具功能异质性需种株水平解析；代谢组整合显示普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)与别孕烷醇酮(allopregnanolone)强正相关，该菌不直接合成别孕烷醇酮但代谢物促其早期生长，宿主类固醇生成酶Srd5a1、Akr1c14表达变化提示转录水平宿主类固醇活性关联，外源别孕烷醇酮减弱MAPK与NF-κB活化、降低炎症与损伤；大肠杆菌(E. coli)攻毒下失调加重疾病，FMT、普雷沃氏菌copri(Prevotella copri)及别孕烷醇酮(allopregnanolone)均关联炎症与损伤减轻，前者上清体外抑大肠杆菌(E. coli)生长。研究者承认局限：未确立直接机制因果、别孕烷醇酮宿主来源及其受菌群影响通路不明、抗生素模型未捕获菌群生态复杂性、未全程同步动情周期存激素变异可能、物种差异限制外推至人与家畜，需稳定同位素示踪、微生物遗传操作及无菌动物系统阐明菌群-类固醇互作与转化相关性。
结论翻译
总之，本研究支持肠道菌群组成、菌群相关代谢物与子宫免疫反应之间的关联。普雷沃氏菌copri(Prevotella copri)与宿主衍生代谢物别孕烷醇酮(allopregnanolone)在失调条件下与炎症反应及上皮屏障完整性变化相关联。这些发现支持菌群-代谢物相互作用可能参与子宫炎症的调节。仍需进一步研究阐明潜在机制并确定这些观察结果的转化相关性。
