壳聚糖水凝胶稳定红细胞膜界面用于环境污染物稳健电化学传感

《Journal of Bioresources and Bioproducts》：Chitosan Hydrogel-Stabilized Red Blood Cell Membrane Interface for Robust Electrochemical Sensing of Environmental Contaminants

　　

由于天然细胞膜整合到功能器件中时固有的不稳定性，稳健仿生界面的开发仍然具有挑战性。在此，研究人员报道了一种基于生物的功能复合材料，其中壳聚糖（chitosan, Chi）衍生的导电水凝胶作为多功能基质，实现了红细胞膜（red blood cell membranes, RBCMs）前所未有的稳定化。利用这种天然多糖的三维聚阳离子网络和丰富的氨基，该水凝胶通过静电锚定RBCMs，同时保留了其天然流动性和膜结合乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase, AChE）构象，克服了生物膜基材料工程中长期的瓶颈。羧化多壁碳纳米管（carboxylated multi-walled carbon nanotubes, cMWCNTs）的整合赋予复合材料高效的电子转移能力，且不损害生物相容性。所得的仿生界面在连续运行7天后保留了85.8%的初始电化学响应，并能够灵敏检测真实农业样品（苹果、橙子和西红柿）中的有机磷农药（organophosphate pesticides, OPs）。这项工作确立了壳聚糖水凝胶作为构建稳定生物膜复合材料的通用生物基平台，扩展了天然多糖在环境监测功能材料设计中的应用范围。

该研究发表于《Journal of Bioresources and Bioproducts》。研究背景方面，食品安全因与公众健康直接相关而具有重要性，食品中农药残留因其长期稳定性和抗降解性对人类健康构成重大威胁，其中有机磷农药（OPs）因优异杀虫效力在市场上占据重要地位。OPs通过不可逆抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）破坏神经递质稳态，可能导致严重中毒或疾病。AChE主要位于红细胞膜（RBCMs）等部位，功能是水解神经递质乙酰胆碱以终止神经传递。现有AChE活性分析技术如荧光法和比色法存在背景信号干扰或探针抑制酶活导致灵敏度降低的问题。电化学生物传感平台虽具操作简便、响应快速、高特异性和试剂消耗少等优势，但AChE为两亲性糖基化四聚体，生理条件下位于细胞膜上，一旦脱离细胞膜会发生构象改变导致功能不可逆改变。现有方法使用商业AChE无法保留其在细胞膜上的天然构象，不能准确反映生理条件下真实活性。细胞膜仿生技术与电化学平台整合虽能保留源细胞膜蛋白天然结构和生物活性，但传统固定化技术制备的生物传感器易发生膜结构脱落，且简单细胞膜包覆技术固有绝缘特性显著阻碍电极表面电子转移效率。因此亟需开发新型仿生电化学生物传感器，构建具有协同增强效应的复合传感界面。研究人员开展了以壳聚糖（Chi）衍生导电水凝胶为多功能基质稳定RBCMs的生物基功能复合材料研究，构建称为高度稳定红细胞膜包覆羧基化多壁碳纳米管/壳聚糖水凝胶修饰电化学生物传感器（HCM-hydrogel e-biosensor）的器件，利用三维聚阳离子网络和丰富氨基静电锚定RBCMs并保留膜流动性和天然AChE构象，整合羧化多壁碳纳米管（cMWCNTs）赋予高效电子转移路径且不损害生物相容性。结论表明该Chi稳定界面连续运行7天后保留85.8%初始电化学响应，能灵敏检测苹果、橙子、西红柿等真实农业样品中OPs，将丰富且可生物降解的天然多糖Chi转化为坚固的生物膜固定化平台，扩展了天然生物资源在构建环境监测功能复合材料中的应用范围。

作者为开展研究用到的主要关键技术方法包括：从健康成年新西兰大白兔抗凝全血通过低温离心、低渗裂解和反复洗涤获取RBCMs的样本队列来源；通过机械搅拌与超声分散制备cMWCNTs-Chi纳米复合凝胶并滴涂于抛光玻璃碳电极（GCE）构建cMWCNTs-Chi/GCE；将RBCMs孵育涂覆于上述电极后滴加牛血清白蛋白（BSA）封闭制备HCM-hydrogel e-biosensor；采用接触角测量、透射电子显微镜（TEM）与能谱（EDS）、扫描电子显微镜（SEM）、原子力显微镜（AFM）表征界面形貌与亲水性；利用双标免疫荧光与共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）定位RBCMs上AChE；通过计时电流法实时监测催化动力学并结合Lineweaver-Burk分析求米氏常数K_m；采用差分脉冲伏安法（DPV）优化RBCMs浓度、孵育时间、pH和温度等实验条件；使用电化学阻抗谱（EIS）和循环伏安法（CV）表征逐步修饰过程的电化学行为；以对硫磷甲基为模型AChE抑制剂测定电流抑制率评估检测性能；对市售苹果、橙子、西红柿样品进行均质提取后以DPV分析实际OPs残留并做加标回收实验。

研究结果如下：

3.1. Morphology of RBCMs and hydrophilicity of HCM-hydrogel e-biosensor

通过双标荧光法确认AChE以天然取向锚定于RBCMs脂质双层上，橙色共定位信号验证结构可行性。接触角测量显示GCE初始81.5°，cMWCNTs-Chi修饰后降至65.1°，RBCMs包覆后进一步降至32.1°，BSA功能化后达14.3°优良亲水性，渐进提升的润湿性减少非特异性吸附并增强生物相容性。

3.2. Structural characterization of HCM-hydrogel e-biosensor

TEM显示cMWCNTs-Chi复合维持碳纳米管管状形态，EDS见碳与氮均匀分布；RBCMs修饰后TEM见明显膜晕，EDS检出C、O、N、S、P等生物膜特征元素证实成功包覆。SEM见Chi粗糙多孔、cMWCNTs纤维缠绕，复合后形成三维多孔架构利于膜固定；电极修饰过程从光滑GCE到cMWCNTs-Chi离散纳米管结构，RBCMs涂覆后变平滑，BSA功能化后呈微凸起，证明层层构建成功。FTIR保留酰胺带1700–1510 cm^–1、脂质3000–2800 cm^–1和磷脂1085–1080 cm^–1特征，表明RBCMs分子特征在制备中得以保留。

3.3. Morphology and anti-fouling performance of HCM-hydrogel e-biosensor

AFM定量显示原始cMWCNTs-Chi层粗糙度平均约2 μm，RBCMs修饰后降至约1 μm，BSA引入后微增，与SEM互补印证可控组装。以BSA-FITC为模型蛋白的CLSM与荧光强度定量显示裸GCE强绿色荧光，cMWCNTs-Chi显著降低，CM-cMWCNTs-Chi/GCE与HCM-hydrogel e-biosensor达背景水平，各阶段较裸电极显著降低（P < 0.001），源于RBCMs界面稳定水化层与Chi固有抗污性协同抵抗生物污垢。

3.4. Characterization of cMWCNTs-Chi hydrogel

振幅扫描中存储模量G'始终高于损耗模量G''，频率扫描中G'持续高于G''，证实水凝胶具弹性主导网络与固态粘弹性动态稳定。溶胀实验初期快速吸水渐趋平衡，溶胀率约500%维持RBCMs周围水合微环境。CLSM追踪显示HCM-hydrogel e-biosensor重复7次测量后DiI标记RBCMs均匀附着，荧光强度保留约90%；对照BSA-CM/GCE仅留约10%，表明cMWCNTs-Chi水凝胶通过Chi氨基与聚阳离子结构静电和氢键相互作用增强RBCMs界面滞留与操作稳定性。

3.5. Kinetic analysis of HCM-hydrogel e-biosensor

加入乙酰硫代胆碱（ATCl）后电流快速显著增强，表明AChE催化产物TCh有效扩散至电极氧化。稳态电流与底物浓度Michaelis-Menten非线性拟合得K_m为0.251 mmol/L，低K_m表明固定于BSA-CM-cMWCNTs-Chi复合上的AChE保留天然构象与催化活性，对ATCl具高亲和力，为构建高灵敏AChE生物传感器提供酶动力学基础。

3.6. Electrochemical behavior of HCM-hydrogel e-biosensor

CV显示cMWCNTs-Chi/GCE峰电流显著高于裸GCE，RBCMs与BSA依次修饰后峰电流渐降且可逆性减弱；EIS中电荷转移电阻R_ct半圆直径变化与之对应，证实逐步构建成功。含5.0 mmol/L ATCl的PBS中DPV在约650 mV见明显AChE氧化峰，无ATCl则无响应，证明电流源于AChE催化反应。加ATCl后BSA-CM/GCE与HCM-hydrogel e-biosensor在约650 mV现不可逆氧化峰，后者因cMWCNTs-Chi优导性峰电流显著更高。氧化峰电流I_pa与扫描速率平方根线性关系良好（R2 = 0.9982），表明TCh氧化为扩散控制电化学过程。

3.7. Optimization of key parameters

RBCMs浓度1–3.5 mg/mL中2.0 mg/mL时电流最大，过高因过厚电子转移阻力增大而下降，故取2.0 mg/mL。孵育时间3–24 h中6 h达峰值，延长则涂层变形下降，选6 h。pH 6.0–8.0中pH 7.4响应最高；温度4、25、37、50 °C中25 °C最高，后续统一25 °C与pH 7.4。

3.8. Method validation

5支同法制备传感器DPV测ATCl峰电流，BSA-CM/GCE相对标准偏差（RSD）7.57%，HCM-hydrogel e-biosensor仅2.62%，具优良重现性。4 °C储存7天每日测DPV，HCM-hydrogel e-biosensor峰电流剩85.8%初始值，BSA-CM/GCE降至28.4%，证实cMWCNTs-Chi凝胶显著提升储存稳定性。

3.9. Electrochemical response of HCM-hydrogel e-biosensor to parathion-methyl

DPV考察对硫磷甲基抑制AChE电流，1×10^–13–1×10^–7 mol/L内随浓度增加氧化电流减小，抑制率与农药浓度对数显著线性相关（R2 = 0.9945），检测限（LOD）估为0.1 pmol/L，半抑制浓度（IC₅₀）为1.84×10^–10 mol/L。对照实验中OPs致信号明显下降，氯氰菊酯与常见干扰物仅微量变化，甲萘威因抑AChE有潜在响应，表明传感器具抗干扰能力，适用于AChE抑制类农药检测。

3.10. Practical application performance

另一常见OP毒死蜱同样在1×10^–13–1×10^–7 mol/L内抑制率与对数线性良好（R2 = 0、9912），LOD 0.1 pmol/L，IC₅₀ 3.79×10^–10 mol/L，具广谱识别。真实苹果、橙子、西红柿样品抑制率分别为14.8%、15.5%、22.7%，对应残留6.7×10^–17、7.6×10^–17、3.0×10^–16 mol/g。加标回收实验苹果82.1%–113.1%、橙子82.1%–89.6%、西红柿92.5%–94.9%，RSD低于10%，证实在多农业基质中准确性与重复性可靠，适于实际样品OPs残留快速检测。与既往OP检测方法比，该传感器线性范围宽、LOD低，以RBCM结合AChE保留膜相关微环境与活性，cMWCNTs-Chi水凝胶稳定仿生界面，具良好重现与储存稳定性。

总结讨论部分，研究结论部分翻译如下：

在本研究中，研究人员开发并制备了一种基于RBCMs仿生修饰的高度稳定电化学生物传感器，即HCM-hydrogel e-biosensor，用于有机磷农药的高灵敏检测。该传感器以锚定于天然RBCMs上的AChE作为识别元件。通过整合导电且稳定的cMWCNTs-Chi凝胶复合材料，有效解决了常规酶固定化伴随的固有活性衰减问题。实验结果表明，该生物传感器对对硫磷甲基实现了0.1 pmol/L的超低密度检测限，线性范围跨越六个数量级（1×10^–13–1×10^–7 mol/L）。该传感器对毒死蜱也表现出有效检测能力，表明其具广谱识别性。它展现出优良的重现性（RSD = 2.62%）与稳定性，在4 °C储存七天后保留了85.8%的初始电流响应。为验证实际适用性，该生物传感器被用于苹果、橙子和西红柿样品中的OP残留分析，对硫磷甲基加标回收率达82.1%–113.1%，RSD低于10%，证实其在真实样品中的抗干扰能力与定量可靠性。本研究建立了一种快速灵敏的OP残留检测方法，在食品安全检测的实际应用中具有广阔前景。