《Journal of Chemical Technology & Biotechnology》：Physical stability of RNA–lipid nanoparticles under agitation, freeze–thaw and accelerated stability testing
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**背景：** 辅料的选择对于增强用于RNA递送的脂质纳米颗粒（LNPs）液体制剂稳定性至关重要，因为制剂在意外经历高温、低温及振动时保持稳定的能力是一个重要属性。在本研究中，研究人员测试了已确立的肠外辅料保护溶液中LNP结构的能力。
**结果：** LNP
**背景：** 辅料的选择对于增强用于RNA递送的脂质纳米颗粒（LNPs）液体制剂稳定性至关重要，因为制剂在意外经历高温、低温及振动时保持稳定的能力是一个重要属性。在本研究中，研究人员测试了已确立的肠外辅料保护溶液中LNP结构的能力。
**结果：** LNP在冻融循环中非常容易受损。减少冰晶损伤最有前景的辅料是蔗糖和甘油。泊洛沙姆188（PX188）、聚山梨酯80（PS80）、牛血清白蛋白（BSA）和海藻糖的效果不如蔗糖和甘油。加速稳定性测试（35°C）观察到LNP的水动力学直径增加。BSA和PS80在35°C时对LNP稳定性有害，导致多分散性指数（PDI）大幅升高。海藻糖、蔗糖和甘油在35°C时的表现优于其他处理组。温和搅拌对LNP结构影响很小。
**结论：** 基于冻融和加速测试的液体制剂首选辅料是蔗糖和甘油。已知蔗糖在脂质体和LNP制剂中有效，而甘油则很少用于脂质体和LNP液体制剂。PS80和BSA在冻融和加速测试中对LNP稳定性有害。PX188在冷冻过程中提供了一定保护，且由于其结构和作用模式与蔗糖和甘油截然不同，可能具有协同效应。
### 论文解读文章
#### 研究背景与问题
脂质纳米颗粒（LNPs）已成为当前RNA治疗药物和疫苗的重要递送载体，通过将RNA包裹在LNP内部，可保护其免受酶降解并促进细胞摄取和内体释放。理想的RNA-LNP液体制剂应在5±3°C下储存超过18个月，且无需复溶即可直接使用，并能在运输和储存过程中耐受温度波动、冻融循环及振动。然而，现有RNA-LNP产品的稳定性表现参差不齐：首个获批的LNP-based siRNA治疗药物Onpattro?（patisiran）以液体形式在2-8°C储存，可耐受25°C达14天，但不耐受冻融；而mRNA-LNP COVID-19疫苗Comirnaty?（Pfizer–BioNTech）和Spikevax?（Moderna）则需在极低温度（-60至-90°C和-15至-25°C）下储存，解冻后仅稳定数小时。因此，筛选能够保护LNP结构免受冻融损伤、高温加速降解及界面剪切影响的合适辅料，是提升RNA-LNP制剂稳定性的关键科学问题。既往脂质体及治疗性蛋白制剂的开发经验表明，蔗糖、海藻糖、甘油、聚山梨酯等辅料在冷冻保护或界面稳定方面具有潜力，但针对LNP系统性的辅料比较研究仍不充分。
#### 研究内容与结论
本研究系统评估了多种已确立的肠外辅料对RNA-LNP在加速稳定性（35°C）、冻融循环（4次循环，-80°C至25°C）及温和搅拌（150 rpm，12 h）条件下的保护效果。研究人员采用动态光散射（DLS）监测LNP的水动力学直径和多分散性指数（PDI）变化，以此表征物理稳定性。研究发现：蔗糖和甘油是冻融过程中最有效的冷冻保护剂，能显著抑制冰晶引起的LNP聚集和PDI升高；在35°C加速测试中，海藻糖、蔗糖和甘油同样表现出最优的稳定性维持能力，而BSA和PS80则导致PDI大幅上升，表明对LNP结构有害；温和搅拌对LNP结构影响极小，且添加表面活性剂（如PS20、PS80、PX188）反而可能引发轻微聚集或PDI升高。该研究论文发表在《Journal of Chemical Technology》。
#### 关键技术方法
研究采用的主要技术方法包括：动态光散射（DLS）测定LNP的水动力学直径和PDI；加速稳定性测试（35°C，14天）；冻融稳定性测试（-80°C冷冻/25°C解冻，4个循环）；搅拌稳定性测试（20°C，150 rpm，12 h）。所有LNP由SM-102、DSPC、胆固醇和PEG-DMG（摩尔比50:10:38.5:1.5）与tRNA在pH 4的醋酸缓冲液中制备，随后透析至pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）中，最终稀释至约30 μg mL
?1。辅料添加浓度分别为：0.05% (w/v) PX188、BSA、PS20、PS80，以及10% (w/v) 甘油、海藻糖、蔗糖。
#### 研究结果
**加速稳定性研究**
在35°C储存7天后，PBS对照组LNP的水动力学直径从123±7 nm升至148±4 nm，PDI稳定在0.24，表明LNP可能发生溶胀或轻微聚并。添加0.05% BSA或0.05% PS80的组别在14天后PDI大幅升高（>0.4），呈现多分散性，提示这两种辅料对LNP结构有害。添加0.05% PX188的LNP直径从85±2 nm升至132±3 nm，但PDI稳定，无明显保护或损害作用。添加10%甘油、海藻糖或蔗糖的组别直径变化较小，其中海藻糖组直径稳定在135±5 nm，PDI约0.19；蔗糖组直径轻微升至120 nm，PDI约0.25；甘油组直径从102±1 nm升至124 nm，PDI约0.25。结论：蔗糖、海藻糖和甘油在35°C下对LNP具有较好的稳定性维持作用。
**冻融稳定性研究**
PBS对照组经历4次冻融循环后，PDI从0.24升至0.72，水动力学直径超过1000 nm，表明LNP严重聚集。添加0.05% PX188后PDI升至0.40，直径升至263±9 nm，保护效果有限。添加0.05% BSA后PDI升至0.28，直径升至183±3 nm，部分保护但直径仍显著增大。添加0.05% PS80后PDI升至0.57，直径升至143±40 nm，保护无效。添加10%海藻糖后直径从146±1 nm升至263±13 nm，PDI从0.18升至0.32，保护不足。添加10%甘油后直径从103±1 nm升至118±1 nm，PDI从0.23升至0.28，保护效果良好。添加10%蔗糖后直径从102±1 nm升至133±3 nm，PDI从0.25升至0.30，保护效果同样显著。结论：蔗糖和甘油是冻融循环中最有效的冷冻保护剂，海藻糖因可能结晶而效果较差，PS80和BSA保护不足或有害。
**搅拌稳定性研究**
PBS对照组在150 rpm搅拌12 h后，水动力学直径从120±1 nm变为118±1 nm，PDI从0.21变为0.19，无显著变化，表明温和搅拌对LNP结构影响很小。添加0.05% PX188后直径从111±5 nm降至98±4 nm，PDI从0.27升至0.41，提示可能破坏LNP。添加0.05% BSA后直径无显著变化（106±1至107±1 nm），PDI稳定在0.25。添加0.05% PS20后直径从90±11 nm升至107±1 nm，PDI稳定。添加0.05% PS80后直径从89±6 nm升至108±1 nm，PDI稳定。结论：LNP对气-水界面吸附不敏感，添加表面活性剂反而可能引起直径或PDI变化，因而不必要。
#### 讨论与结论
讨论部分指出，LNP在冻融循环中极易受损，这与冰晶形成及浓缩效应导致的机械力有关。蔗糖和甘油作为冷冻保护剂的优异表现，源于其通过降低冰晶生长速率和改变溶液玻璃化转变温度来保护LNP；而海藻糖因在冷冻过程中易自发结晶，反而可能加剧损伤。加速稳定性测试中BSA和PS80的有害作用，可能与其与LNP表面疏水区域的直接相互作用及界面张力改变有关。温和搅拌对LNP影响甚微，表明LNP在气-水界面的吸附风险较低，无需额外添加表面活性剂。
**研究结论翻译：**
LNP在冻融循环中非常容易受损，不容忽视。意外冻融是5±3°C储存和运输过程中间歇性发生的问题。LNP对冷冻损伤的易感性并不意外，因为LNP质地柔软，而冰晶在某些条件下能够施加相当大的力。减少冰晶损伤最有前景的辅料是蔗糖和甘油。尽管水动力学直径和PDI略有增加，但蔗糖和甘油的表现优于其他处理组。海藻糖效果不佳，这可能与其在冷冻过程中易于结晶有关。在无额外辅料的PBS中，LNP在35°C加速稳定性测试中水动力学直径在7天内增加20%，随后在7至14天之间仅进一步增加1%。0.05% (w/v) BSA和0.05% (w/v) PS80在35°C时对LNP稳定性有害，导致PDI大幅升高，表明这些辅料不适用于所研究的LNP液体制剂。PX188未能阻止LNP水动力学直径的增加，但PDI稳定，表明对LNP结构无有害影响。海藻糖、蔗糖和甘油的表现优于其他辅料。基于冻融和加速测试的液体制剂首选辅料是蔗糖和甘油。蔗糖的效果并不意外，因为它已在多种组成的脂质体和LNP制剂中有效。甘油则很少用于脂质体和LNP液体制剂。PS80在本研究中对LNP稳定性有害。BSA因加速稳定性结果不佳，也不适合用于LNP储存。0.05% (w/v) PX188在冷冻过程中提供了一定保护，且由于其结构和作用模式与蔗糖和甘油截然不同，该辅料可能值得与蔗糖和甘油联合测试，以验证其对冰晶损伤的保护是否具有互补性。
