用于同时测定多种尿液挥发性有机化合物代谢物的宽谱分析方法

《Journal of Chromatography A》：Broad-spectrum analytical method for the simultaneous determination of multiple classes of urinary volatile organic compound metabolites

　　•通过固定相-分析物-流动相分配平衡实现分离优化。•该方法的可靠性已通过外部质量评估程序得到验证。•由于符合绿色化学原则，该方法适合推广应用。•不同亚组中mVOCs浓度存在显著差异。引言自20世纪50年代第三次工业革命以来，工业化的快速发展极大地改善了人类的生活环境和生活质量[1,2]。人为产生的挥发性有机化合物（VOCs）是一类重要的工业化学品和环境污染物，其排放量不断增加[3]。这些排放物来源于工业过程、汽车尾气、烟草烟雾以及室内装饰物等[【4】, [【5】, [【6】]]。据估计，全球超过三分之一的人口暴露在有害水平的VOCs中[7]，这引发了重大的公共卫生问题。长期接触VOCs可能对神经系统造成损害，还可能导致肝脏损伤，增加慢性支气管炎和哮喘的发病风险，甚至诱发白血病[【8】, [【9】, [【10】]]。此外，接触多种VOCs混合物还会增加患各种慢性疾病的风险，包括肺气肿、非致命性心脑血管疾病、慢性肾病以及肝脂肪变性[【11】, [【12】, [【13】, [【14】]]。在此背景下，生物标志物分析已成为慢性疾病监测的核心策略[【15】]。另外，外部压力因素可能会在分子层面打破脂质和葡萄糖的稳态，这就更加凸显了拥有可靠生物监测工具的必要性[【16】]。除了代谢功能障碍之外，包括苯、丙烯腈、1,3-丁二烯、环氧乙烷和氯乙烯在内的多种VOCs已被国际癌症研究机构（IARC）列为1类致癌物，表明它们具有致癌潜力[【17】]。接触VOCs会导致多种健康问题，对公共健康构成威胁（详见表S1）[【18】]，这也凸显出有必要对普通人群的VOCs暴露水平进行监测。在现有的检测方法中，由于便捷且成本较低，测量外部VOCs暴露往往更受青睐[【18】, [【19】]。然而，VOCs源自多种来源，在环境中普遍存在。外部暴露评估方法仅能针对特定来源，因此会导致估算结果不准确。吸入是人类接触VOCs的主要途径，而摄入和皮肤接触则属于次要途径。通过对人体内VOCs及其代谢物的生物监测，可以全面评估来自所有来源和途径的总体暴露情况[【20】]。一旦进入血液，VOCs会通过谷胱甘肽或P450途径在肝脏中迅速代谢，生成巯基酸（N-乙酰-L-半胱氨酸-S-结合物）、羧酸或吡咯烷类代谢物，最终通过尿液排出体外[【21】, [【22】]。与血液中的VOCs相比，尿液中的VOCs代谢物（mVOCs）具有更好的特异性和更长的代谢半衰期，因此是评估体内暴露情况的理想生物标志物。此外，尿液采集无需侵入性操作，比抽血更为方便，这也进一步确立了尿液作为VOCs暴露生物监测首选样本的地位。烟草燃烧是非职业性VOCs暴露的重要来源[【21】]。此外，吸烟还会干扰肝脏中VOCs的代谢。烟草烟雾中的尼古丁及其他成分会调节肝脏细胞色素P450酶的活性，而这些酶在VOCs的生物转化过程中起着关键作用。因此，接触烟草烟雾会改变VOCs代谢物（mVOCs）的生成及尿液排泄情况。此外，吸烟相关生物标志物以及VOCs衍生代谢物的物理化学性质也存在差异。由VOCs代谢产生的巯基酸和羧酸具有酸性，而由尼古丁经P450酶作用生成的吡咯烷则呈碱性[【23】]。因此，目前关于VOCs暴露健康危害的研究需要检测具有不同性质的各类mVOCs[【24】]。这其中包括能够反映烟草暴露的生物标志物，如可替宁（COT）[【25】]。此外，苯作为一种已被明确认定为人类致癌物的物质，长期以来一直被列为全球各地人群监测项目的重点监测对象。其特定的尿液生物标志物是N-乙酰-S-(苯基)-L-半胱氨酸（PMA），它以游离形式以及其前体N-乙酰-S-(6-羟基-2,4-环己二烯-1-基)-L-半胱氨酸（pre-PMA）的形式存在于尿液中。pre-PMA占总PMA量的二分之一以上[【26】, [【27】]，并且可以完全转化为PMA，因此在强酸性条件下也可被检测到[【28】]。检测总PMA能够更全面地评估苯的暴露情况，因此被认为比单独检测游离PMA更为有效。在全球范围内，已有多个国家通过使用尿液中的mVOCs作为生物标志物来开展VOCs暴露的生物监测工作。尽管这些研究都采用了高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）作为分析仪器，但不同的研究采用了不同的样品前处理技术。美国国家健康与营养检查调查项目（NHANES）采用稀释进样法，使用0.05毫升的尿液来检测由19种母体VOCs衍生的28种尿液mVOCs[【21】]。由于在样品前处理过程中没有进行酸水解，苯暴露的监测仅限于游离PMA，这可能会导致环境监测与生物监测结果之间存在误导性的关联。相比之下，加拿大健康状况调查项目（CHMS）则专门针对尿液中的苯代谢物[【29】]。在该方法中，首先将尿液样本（0.4毫升）酸化至pH 1.4，然后再对反式反式粘康酸（MU）和PMA进行固相萃取，这两种物质都是苯暴露的生物标志物[【27】]。尽管也检测了总PMA，但由于仅关注苯代谢物，未能考虑到人们通常会同时接触多种VOCs的情况，从而导致对总体VOCs暴露情况的评估不够全面。Pluym等人为了德国环境调查项目（GerES）开发了多种分析方法，用于检测18种尿液mVOCs，其中包括总PMA[【30】]。这些目标分析物被分为两组分别处理。在第一组（包含10种mVOCs）中，尿液样本先被盐酸酸化以水解pre-PMA，随后用氢氧化钠和甲酸盐缓冲液调整样本pH值，再经过离心处理后进行仪器分析。第二组分析物（8种mVOCs）则在溶剂交换后再单独测定。虽然这种策略通过调整样本pH值实现了对PMA的全面检测，但繁琐的多组样品前处理流程以及需要多次进行仪器分析，降低了工作效率并增加了分析成本。尽管如此，这种方法仍为扩大mVOCs的检测范围做出了重要贡献。在意大利的普通人群暴露生物监测项目中，也检测了总PMA，该研究使用3毫升的尿液来测定总PMA、MU和COT[【31】]。尿液样本先用6N盐酸酸化至pH 2，然后使用基于C18的固相萃取柱进行净化。COT收集在洗涤液中，而MU和PMA则存在于洗脱液中，这些洗脱液在注入HPLC-MS/MS之前还需经过过滤处理。这种方法试图通过检测吸烟相关的生物标志物COT，将苯暴露与一个共同来源联系起来，具有一定价值。不过，该研究的检测目标仅限于三种化学物质，而且用于检测COT的仪器方法与其他分析物的检测方法不同。Qian等人也采用了稀释进样法，同时检测COT以及其他22种mVOCs[【25】]。他们将0.1毫升的尿液样本用0.5毫升浓度为0.05%的甲酸溶液稀释，过滤后，再使用HPLC-MS/MS进行分析。Srivastava等人也采用了稀释进样法来定量35种mVOCs和烟草生物碱代谢物[【32】]。与NHANES所采用的方法类似，这两种方法对苯暴露的检测也仅限于游离PMA。尽管烟草烟雾在普通人群的VOCs暴露中起着重要作用，但作为一种已被广泛研究的吸烟生物标志物，COT却很少与mVOCs一起被检测。作为一种吡咯烷类生物碱，COT的物理化学性质与巯基酸和羧酸有所不同，因此需要采用不同的分析方法来进行检测。较高的检测成本给大规模监测人群的VOCs暴露带来了困难。在本研究中，我们着眼于那些在普通人群中暴露程度较高且出现频率较高的特定尿液mVOCs，这些指标是根据以往研究确定的，包括反映烟草暴露的生物标志物以及不同状态下的PMA。根据目标分析物的物理化学性质，我们精心设计了实验流程，并优化了样品前处理和仪器检测等关键技术环节，从而实现了对人类尿液中多种mVOCs的同时检测。该方法已经经过了严格的质量控制评估，并且符合绿色化学理念。它已被纳入中国国家人体生物监测计划，用于大规模监测人群中的mVOCs暴露情况。化学品与试剂甲醇（HPLC级）购自中国苏州的Fisher Chemical公司。甲酸（HPLC级）则来自中国上海的CNW公司。分析级的盐酸（浓度为36 - 38% w/w）和氢氧化钠均购自中国上海的国药集团化学试剂有限公司。超纯水则由美国马萨诸塞州的Millipore公司生产的Milli-Q系统制备。18种mVOCs的详细化学名称及其他相关信息见补充材料中的表S2。所有分析标准质谱参数的优化VOCs在肝脏中会发生代谢转化，生成含有硫元素的巯基酸或具有酸性官能团的羧酸，或是具有碱性官能团的吡咯烷类生物碱[【21】]。具有不同酸碱性质的化学物质，其质子亲和力也各不相同。因此，采用不同的电离模式可以获得更全面的离子碎片信息，便于同时获取数据。本研究采用了多反应监测模式（MRM模式）来进行检测。结论通过精心设计的实验流程，本研究成功实现了对处于不同状态下的尿液mVOCs的同时检测，这些检测指标包括两种烟草暴露生物标志物以及总PMA。对于那些既以未水解形式存在又以游离形式存在的多种mVOCs的提取问题，我们通过调整pH值优化了样品前处理工艺得以解决。通过用盐酸水解pre-PMA，从而实现了总PMA的定量检测。碱性的……作者贡献：CRediTTian Qiu：撰写——初稿、方法学、数据整理、可视化。Xiaohong Yu：撰写——初稿、正式分析。Jingyu Wang：正式分析。Xue Bai：正式分析。Qi Sun：可视化。Hongyang Cui：撰写——审阅与编辑。Song Tang：撰写——审阅与编辑。Yifu Lu：方法学、撰写——审阅与编辑、概念设计、监督。Xiaoming Shi：撰写——审阅与编辑、概念设计、监督、资金筹集。资金来源本研究得到了中国国家自然科学基金（编号为82388102、82530104、82241091）、中国疾病预防控制中心青年科学基金（编号2023A201）以及中国疾病预防控制中心国家环境卫生研究所青年科学研究基金（编号2025YSR01）的支持。人类伦理与参与同意声明本研究已获得中国疾病预防控制中心国家环境卫生研究所伦理委员会的批准（批准号为201904）。所有涉及人类参与者的实验步骤均遵循该机构及国家研究委员会的伦理标准，同时也符合1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修订版的要求。参与同意所有个体参与者及其父母、监护人或法定代理人均签署了书面知情同意书。CRediT作者贡献声明Tian Qiu：撰写——初稿、可视化、方法学、数据整理。Xiaohong Yu：撰写——初稿、正式分析。Jingyu Wang：正式分析。Xue Bai：正式分析。Qi Sun：可视化。Hongyang Cui：撰写——审阅与编辑。Song Tang：撰写——审阅与编辑。Yifu Lu：撰写——审阅与编辑、监督、方法学、概念设计。Xiaoming Shi：撰写——审阅与编辑、监督、资金筹集、概念设计。利益冲突声明作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。Tian Qiu|Xiaohong Yu|Jingyu Wang|Xue Bai|Qi Sun|Hongyang Cui|Song Tang|Yifu Lu|Xiaoming Shi