《Journal of Chromatography B》：Development and validation of an LC–MS/MS method for the quantification of the KRASG12C inhibitor divarasib
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•首次开发了用于十种不同基质中检测divarasib的生物分析方法。•通过蛋白质沉淀法可获得可接受的回收率及较低的基质效应。•该方法已成功应用于小鼠的药代动力学初步研究。引言Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（KRAS）是人类癌症中最常发生突变的癌基因之一，尤其在非小细胞肺癌
• 首次开发了用于十种不同基质中检测divarasib的生物分析方法。
• 通过蛋白质沉淀法可获得可接受的回收率及较低的基质效应。
• 该方法已成功应用于小鼠的药代动力学初步研究。
引言 Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（KRAS）是人类癌症中最常发生突变的癌基因之一，尤其在非小细胞肺癌、胰腺导管腺癌和结直肠癌中较为常见[1]。大多数KRAS突变发生在第12个密码子处，从而导致该蛋白持续处于活性状态，其中KRASG12C 变异在非小细胞肺癌患者中最为普遍[2]。近期获批的KRASG12C 抑制剂adagrasib和sotorasib虽已显示出临床疗效，但其效果仍有限，这凸显出为这类患者寻找更有效且持久的治疗方案的必要性[3]、[4]。
Divarasib（GDC-6036）是一种新一代共价型KRAS
G12C 抑制剂，在临床前研究中的效力比adagrasib和sotorasib高5到20倍[5]。在完成I–II期临床试验后，由于初步结果显示其具有良好的抗肿瘤活性且耐受性良好，目前正在进行III期试验（
NCT06497556 ）。与早期的KRAS
G12C 抑制剂类似，divarasib也含有丙烯酰胺结构，它能与KRAS
G12C 第12位的半胱氨酸残基形成共价结合，从而使该蛋白始终处于无活性的GDP结合状态。不过，divarasib还包含一种独特的三氟甲基吡啶结构，这一结构能够很好地契合KRAS开关II区域内的疏水口袋，进而提升其效力与选择性[6]、[7]。
在非小细胞肺癌患者中，那些每日口服50–400毫克divarasib的患者，其无进展生存期中位值为13.1个月，且未出现与剂量相关的毒性反应（相关临床试验：
NCT04449874 ）[5]。尽管这些研究结果令人振奋，但divarasib的药代动力学和药效学特性仍未被完全阐明，而这些特性对于指导未来的临床应用至关重要。为进一步了解药物转运蛋白和药物代谢酶对divarasib血浆浓度及组织分布的影响，我们利用多种基因改造的小鼠模型开展了一系列体内研究。为了支撑这些研究并准确测定血浆和组织样本中的divarasib浓度，开发一种可靠的方法来定量检测小鼠血浆和组织样本中的divarasib显得十分必要。
截至目前，仅有一篇已发表的研究报道了采用LC–MS/MS技术对divarasib进行定量分析，该研究仅针对小鼠血液样本，并且依赖蛋白质沉淀法。不过，该研究既没有采用经过验证的分析方法，也未将分析范围扩展到人类血浆或小鼠组织样本[8]。因此，我们的研究旨在建立、优化并验证一种灵敏且稳定的LC–MS/MS分析方法，用于检测人类血浆、小鼠血浆以及八种不同类型小鼠组织匀浆中的divarasib含量。这一经过验证的分析方法可为临床前和临床研究提供有力支持，帮助人们更深入地了解divarasib的暴露程度、分布情况以及潜在的疗效与安全性。
章节要点 药物与试剂 Divarasib（99%，半水合物）购自ChemieTek（美国印第安纳波利斯）。Erlotinib HCl（纯度＞99%）来自Sequoia Research Products（英国庞伯恩）。牛血清白蛋白购自罗氏诊断公司（德国曼海姆）。甲酸购自Sigma-Aldrich Chemie（德国达姆施塔特）。二甲基亚砜购自默克公司（德国达姆施塔特）。甲醇和乙腈均购自Biosolve公司（荷兰瓦尔肯斯瓦尔德）。所有试剂
实验结果 由于需要一种足够灵敏且准确的分析方法来检测十种浓度范围差异极大的不同生物基质中的divarasib，所以我们选择了LC–MS/MS技术。色谱方法的优化是依据质谱响应、峰形以及保留时间来进行的。图1展示了一份小鼠血浆样本的典型色谱图。空白血浆样本的色谱图中未出现任何divarasib信号（见补充图1）。Divarasib和
讨论 当样品浓度达到10,000 nM时，观察到了残留效应。而当浓度为2000 nM时，所有计算出的残留效应值均低于LLOQ判定标准的20%。因此，该LC–MS/MS分析方法已被验证可用于以2000 nM作为定量上限的校准曲线。浓度超过此值的样品应进行稀释，然后在验证过的浓度范围内重新进行分析。不同基质中divarasib的基质效应及回收率存在差异。
结论 我们成功开发出一种简单且具有选择性的LC–MS/MS分析方法，可用于检测人类血浆样本以及包括大脑、肝脏、脾脏、肾脏、小肠、小肠内容物、肺和睾丸在内的多种小鼠组织匀浆中的KRASG12C 抑制剂divarasib，同时该方法也在小鼠血浆中得到了部分验证。我们所开发的这种方法能够可靠地检测小鼠脑组织样本中低至1 nM浓度的divarasib，且样品处理过程仅需简单的蛋白质沉淀步骤即可完成
作者贡献说明 Jamie Rijmers： 撰写原文初稿、数据可视化、项目管理、方法设计、实验实施、正式数据分析、概念构思。Vi?t Bui： 撰写文本的审阅与编辑工作、数据可视化、项目管理、方法设计、实验实施、正式数据分析、概念构思。Maria C. Lebre： 负责文本的审阅与编辑、资源协调工作。Alfred H. Schinkel： 参与文本的审阅与编辑、项目监督、资源调配以及资金申请工作。Jos H. Beijnen： 负责文本的审阅与编辑、项目监督以及资金筹集工作
资金来源 本研究并未获得公共部门、商业机构或非营利组织提供的任何专项资助。本研究的部分经费由荷兰癌症研究所 的常规资金支持。而荷兰癌症研究所 的各项研究工作则得到了荷兰癌症协会 以及荷兰卫生、福利与体育部 的资助。
利益冲突声明 作者声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
Jamie Rijmers|Vi?t Bui|Maria C. Lebre|Alfred H. Schinkel|Jos H. Beijnen|Olaf van Tellingen|L.J. van Winden
