《Journal of Chromatography B》：Mitigating pH-induced instability in deruxtecan-based ADCs: an onboard-mixing icIEF approach for robust charge heterogeneity characterization
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•本研究开发了一种内置混合的icIEF分析方法，用于可靠地分析基于DXd的ADC电荷变异体。•内置混合技术通过降低有效载荷的不稳定性，保持了蛋白质原有的电荷特征。•该方法展现出出色的定量性能、特异性以及日间重复性。引言抗体-药物偶联物（ADCs）作为一种靶向治疗手段，正快速发展，
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本研究开发了一种内置混合的icIEF分析方法，用于可靠地分析基于DXd的ADC电荷变异体。
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内置混合技术通过降低有效载荷的不稳定性，保持了蛋白质原有的电荷特征。
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该方法展现出出色的定量性能、特异性以及日间重复性。
引言
抗体-药物偶联物（ADCs）作为一种靶向治疗手段，正快速发展，它结合了单克隆抗体的高特异性与小分子有效载荷的强细胞毒性[1]、[2]、[3]。过去十年中，抗体工程、连接子化学以及有效载荷设计方面的显著进展，使得ADCs越来越复杂，其治疗效果也不断提升。然而[4]、[5]，这种结构复杂性也带来了显著的分子异质性，这些异质性源于药物与抗体的比例、结合位点、翻译后修饰以及化学降解途径等方面的差异，比如光敏感导致的不稳定性[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]。这类异质性给分析工作带来了巨大挑战，因此需要强大且高分辨率的分析方法。
在各种关键质量属性中，电荷异质性尤为重要，因为它涉及多种化学和结构上的变化[13]、[14]、[15]、[16]，包括脱酰胺、氧化、糖基化以及与连接子或有效载荷相关的转化。电荷分布的变化会影响蛋白质的构象、稳定性、药代动力学特性以及生物活性。对于ADCs而言，有效载荷的不稳定性和连接子化学也可能导致电荷变化，进一步增加了分析的难度[17]。因此，准确表征电荷变异体不仅对工艺开发和比较研究至关重要，对整个产品生命周期中的监管评估和质量控制也同样重要。
成像毛细管等电聚焦技术已成为分析生物制药中电荷变异体的常用方法。通过在毛细管内建立稳定的pH梯度，并根据分析物的等电点将其分离，icIEF技术能够以低样本消耗量实现高分辨率的电荷异质性分析，同时还支持直接紫外检测[18]、[19]、[20]、[21]、[22]。与传统离子交换色谱及其他毛细管电泳方法相比，icIEF具有更高的分辨能力且方法更为简单，非常适合分析像ADCs这样高度异质的分子。仪器方面的进步，如全柱成像检测技术和改进的两性电解质体系，进一步提升了icIEF在研究和监管环境中的应用能力和可靠性[18]。
尽管有这些优势，icIEF分析的可靠性仍然在很大程度上取决于样品制备条件，尤其是对于那些对pH值或缓冲液成分敏感的分子。在典型的分析流程中，ADC样品会在进样前与两性电解质及添加剂预先混合，从而使分析物在温和的碱性环境中暴露一段时间。对于化学性质稳定的蛋白质来说，这一步通常不会带来明显的问题。但对于含有不稳定功能基团的ADCs而言，这样的处理可能在icIEF分析开始前的聚焦过程之前就引发结构变化，从而改变其表观电荷分布。
基于Deruxtecan（DXd）的ADCs就是这类分析难题的典型代表。DXd有效载荷源自喜树碱类似物，其中所含的内酯环对其生物活性至关重要，但在中性到碱性条件下极易发生水解[17]、[23]、[24]。在传统icIEF样品制备过程中，当该分子接触到两性电解质时，内酯环会迅速开环，形成极性更强且带负电荷的羧酸根物种。这一变化会导致酸性变异体数量人为增加，而且电荷分布还会随时间逐渐发生变化。因此，对基于DXd的ADCs进行icIEF分析时，其重复性往往较差，尤其是在酸性区域，时间带来的变化会掩盖分子本身的异质性，影响数据的可靠性[17]。
先前的研究已经指出，诸如琥珀酰亚胺反应或内酯环开环反应之类的化学变化，会影响ADCs的电荷特性，进而影响其稳定性和功能[17]、[25]、[26]。虽然这些研究为相关机制提供了宝贵见解，但大多数研究都集中在了解降解途径或通过修改分子结构来提高其在体内的稳定性上。相比之下，对于样品处理和制备过程中产生的分析干扰因素，人们关注得相对较少，而这些因素同样会对准确分析造成重要影响。对于icIEF这类技术而言，这种差距尤为突出，因为即使短时间内处于非天然环境，也可能会显著影响分析结果。为了解决这一问题，我们开发了一种采用内置混合进样策略的icIEF分析方法，即在进样前将ADC样品与两性电解质分开保存，然后在仪器内部实时混合。通过缩短样品在碱性环境中的暴露时间，这种方法有效避免了内酯环的过早开环，从而在分析过程中保持了基于DXd的ADCs的原有电荷分布，如图1A所示。
在本研究中，我们通过全面的方法开发与验证，系统地评估了内置混合策略的性能。我们分析了包括运行间重复性、日内精密度、等电点测定、峰面积分布、线性以及灵敏度在内的各项分析参数，并将其与传统预混合方法的结果进行了比较。研究结果表明，内置混合显著提高了对基于DXd的ADCs进行icIEF分析的稳健性和可靠性，无需对样品的pH值进行复杂调整，同时也减少了分析过程中带来的变异。总体而言，本研究表明，在基于电荷的分析技术中，样品处理起着至关重要的作用，同时也为分析化学性质脆弱的ADCs提供了实用的解决方案。所提出的方法不仅提升了icIEF在分析基于DXd的ADCs时的性能，还可应用于其他含有对pH值敏感功能基团的生物制剂。
章节节选
化学品
AESlyte? HR 3.0–10.0和HR 7.5–8.5两性电解质、等电点标记物（pI为6.61和9.46），以及阳离子液和阴离子液等电解质溶液，均购自加拿大安大略省剑桥市的Advanced Electrophoresis Solutions Ltd.公司。本研究所使用的基于DXd的ADC样品以及未结合抗体的单克隆抗体样品，由国家食品药品监督管理局提供。尿素、精氨酸和甲基纤维素则来自Fisher Scientific公司，均为分析级产品。超纯水（电阻率≥18.2?MΩ·cm）则
在传统预混合条件下基于DXd的ADCs的不稳定性
首先，我们采用传统的预混合流程，评估了在icIEF样品制备过程中基于DXd的ADCs的稳定性。在这种流程中，ADC样品会在进样前与两性电解质及添加剂混合，然后储存在4?°C的自动进样器中。在这些条件下，如图2所示，电荷变异体的分布会随着时间的推移而发生明显变化。
具体而言，我们在样品制备后的不同时间点收集了电泳图谱，比如0小时、3小时、6小时、9小时、12小时以及24小时。
结论
在本研究中，我们开发并验证了一种采用内置混合进样策略的icIEF分析方法，用于分析基于DXd的抗体-药物偶联物中的电荷变异体。研究发现，传统的预混合方法会导致电荷分布出现显著的时间依赖性变化，其主要原因是DXd的内酯环在含有两性电解质的条件下会发生水解。这一过程使得酸性变异体数量增加，进而影响了分析的准确性
作者贡献
吴刚和崔春波负责开发分析流程，并为包括实验和数据处理在内的整体研究提供了资金支持；余传飞提出了该研究思路，并参与了手稿的修改工作；李萌和于晓娟提供了资金援助；博奥田、张晓溪和郭璐云则参与了手稿的撰写，包括讨论部分、图表的制作等。所有合作作者都参与了包括实验设计在内的关键细节的讨论。
CRediT作者贡献说明
吴刚：撰写——初稿、方法学、资金获取、概念构思。崔春波：撰写——初稿、方法学、资金获取。博奥田：软件使用、正式分析。张晓溪：验证、数据整理。李萌：资金获取。于晓娟：资金获取。郭璐云：验证、数据整理。余传飞：撰写——审阅与编辑、资金获取、概念构思。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
本研究得到了“新发重大传染病防控研究——国家科技重大专项”（项目编号2025ZD01904200）、中国国家重点研发计划（项目编号2023YFC3404004）、北京市科学技术委员会（项目编号：Z251100004625003）以及“药品监管科学国家重点实验室项目”（项目编号：2025SKLDRS0336、2025SKLDRS0318）的支持。同时也要感谢任慈诚和陈梦宇的帮助。
Gang Wu|Chunbo Cui|Aotian Bo|Xiaoxi Zhang|Meng Li|Xiaojuan Yu|Luyun Guo|Chuanfei Yu
