磷酸盐辅助的三钙硅酸盐水合反应可促进羟基磷灰石的形成，并提升成骨潜能

《Journal of Dentistry》：Phosphate-assisted hydration of tricalcium silicate promotes hydroxyapatite formation and enhances osteogenic potential

　　

摘要

硅酸三钙（TCS）是一种已被临床广泛应用的钙硅酸盐基材料。然而，其高度碱性的水合环境会限制细胞与其的相容性。本研究探讨了在TCS水合过程中直接加入磷酸盐溶液是否能够促进缺钙羟基磷灰石（CDHAp）的形成，调节溶液的化学性质，并增强成骨生物反应。研究采用固定液粉比，将TCS与KH₂PO₄溶液按0、5、10、15和20 wt%的比例混合，即TP0–TP20组。将样品浸入模拟体液中最多28天后，通过X射线衍射（XRD）和X射线光电子能谱（XPS）分析晶相演变情况，利用扫描电子显微镜（SEM）观察表面形态，通过ICP-OES检测溶液的pH值、溶解度以及钙离子、硅离子和磷酸根离子的释放量。此外还通过RT-qPCR检测MC3T3-E1前成骨细胞中与成骨相关的基因表达情况，同时利用定制的微流控芯片系统评估细胞在生理条件下的存活率和迁移能力。研究表明，从第1天起，TP15和TP20组中就出现了浓度依赖性的CDHAp形成，且其峰值强度在28天内逐渐上升；而TP0组中CDHAp的形成程度过低，无法通过XRD清晰检测到。较高的磷酸盐含量会逐渐降低溶液的pH值，抑制游离钙离子的积累，使早期阶段的钙离子浓度保持在2–6 mM之间，同时增加硅离子的释放量。与TP0组相比，TP15和TP20组中RUNX2、OSX和COL1A1基因的表达显著升高（p < 0.05）。在微流控系统中，TP0组没有存活的细胞，而TP20组则表现出细胞向样品表面的定向迁移现象。这些结果表明，在TCS水合过程中加入磷酸盐溶液能够加速CDHAp的结晶，缓解过高的碱性环境，进而提升流动条件下的早期成骨分化能力和细胞迁移能力。这些发现为通过磷酸盐改性TCS来改善羟基磷灰石的形成及其化学和生物性能提供了新的策略。

引言

硅酸三钙（TCS，化学式为Ca₃SiO₅）是矿物三氧化聚合体（MTA）的主要活性成分，而MTA则是牙科领域应用最广泛的材料之一，可用于牙髓封闭、根尖填充以及穿孔修复等操作[[1], [2], [3], [4]]。由于其具备良好的生物相容性、密封性、抗菌性，还能释放具有生物活性的钙离子和硅离子，因此人们对其在牙科之外的应用也产生了浓厚兴趣，尤其是在骨科手术中作为骨替代物和支架材料[[5,6]]。最近的研究进一步探索了将TCS与聚己内酯（PCL）或聚乳酸（PLA）等聚合物结合使用，构建具有可调控孔隙率和离子释放特性的个性化支架，用于三维组织工程构建[[7], [8], [9]]。此外，人们还通过溶胶-凝胶法、掺入磷酸钙、强化水凝胶结构以及采用抗菌复合材料等方法，对基于TCS的牙科生物材料进行改进，以控制其合成过程、水合行为、注射性能、抗冲刷性能、成牙本质潜力以及抗菌效果[[10], [11], [12], [13]]。

当TCS与水接触时，会经历一个放热型的溶解-沉淀过程。溶解后的物质会重新沉淀为钙硅酸氢盐（C-S-H）和氢氧化钙（Ca(OH)₂），从而使周围环境的pH值升至12以上[[14,15]]。虽然这种高碱性环境具有抗菌作用，但长期暴露在这种环境中会损害细胞的存活能力，抑制细胞粘附，还可能阻碍骨整合。因此，如何在保持或进一步提升成骨离子环境的同时降低碱性，是临床上亟需解决的重要问题。

多项研究表明，当预水合的TCS或MTA表面接触到含有磷酸盐的液体时，表面会形成并生长出羟基磷灰石（HAp）或缺钙羟基磷灰石（CDHAp）[[16], [17], [18]]。由于硅烷醇基团的存在，C-S-H凝胶层带有净负电荷，可作为成核模板，吸附钙离子和磷酸根离子，从而促进磷灰石晶体的生成[[19]]。不过，现有研究大多是在水合过程已经发生后才分析磷酸盐与材料的相互作用。而如果直接在混合液中加入磷酸盐，就可以从一开始就改变水合动力学，促使CDHAp在C-S-H形成的同时结晶，同时消耗掉溶液中的氢氧根离子，从而更早且更有效地降低溶液的碱性。

基于此，本研究设置了两个相互补充的目标：一是探究TCS混合液中不同浓度的磷酸盐对晶相形成的影响，二是通过定制的微流控灌注模型评估由此产生的成骨生物反应。研究的零假设是：磷酸盐浓度不会对晶相组成、材料的化学性质以及细胞层面的成骨反应产生任何影响。

内容片段

材料

本研究以硅酸三钙（TCS，由美国德克萨斯州凯蒂市的Bonding Chemical Inc.公司提供）和一价磷酸钾（KH₂PO₄，由美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich公司提供）作为起始原料，使用去离子水配制溶液。所有材料均直接使用，未进行进一步纯化处理。

实验组制备

通过将一价磷酸钾溶解在去离子水中，制备出了含0、5、10、15和20 wt% KH₂PO₄的磷酸盐溶液。选择这一浓度范围是基于

对TCS样品晶相变化的分析

图2展示了将TP0–TP20组样品浸入模拟体液1–28天后所得的XRD图谱。在第1天时，所有组别都出现了未被反应的TCS对应的特征反射峰（2θ ≈ 29.3°和32.2°）以及碳酸钙对应的反射峰（2θ ≈ 23.1°），而在TP0–TP10组中并未出现CDHAp的反射峰。在TP15和TP20组中，第1天时就已经出现了较弱的CDHAp反射峰（2θ ≈ 31.7°、32.9°和34.0°）。随着浸泡时间的延长，TP15组中的CDHAp峰强度逐渐上升（在第14天首次可被检测到），TP20组则从第7天开始强度逐渐升高，到后期这些峰变得十分明显。

讨论

由于具备出色的密封性、生物相容性、抗菌能力以及良好的机械强度，硅酸三钙在牙科领域得到了广泛应用。当TCS在水中水合时，会生成C-S-H和氢氧化钙。这些晶体在含水环境中会发生分解，释放出钙离子和硅离子。不过，离子的释放会导致环境呈现碱性，虽然这种碱性有利于发挥抗菌作用，但过高的碱性环境（pH值大于12）却可能带来不利影响

结论

研究证明，在TCS水合过程中直接加入磷酸盐溶液是一种有效的方法，能够提升硅酸三钙的化学性能和生物性能。

• (1)
  在水合过程中加入磷酸盐溶液后，TCS向CDHAp转化的速度更快，且随着浸泡时间的延长，其晶相也会发生明显变化。
• (2)
  经磷酸盐溶液处理的TCS能够降低过高的碱性水平。离子释放分析结果显示，钙离子浓度得到了有效调控，游离钙离子的水平也处于适宜范围

作者贡献说明

Sung-Yun Byun：负责撰写原文初稿、项目管理、方法设计、实验实施、数据分析、数据整理以及研究构思工作。Su-Jeong Min：负责文章的审阅与编辑工作。Jae-Sung Kwon：负责文章的审阅与编辑、结果验证、研究监督、资源协调、方法设计、资金申请以及研究构思工作。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

本研究得到了韩国政府科研技术信息通信部资助的韩国国家研究基金会（NRF）项目支持，项目编号为NR072036。

Sung-Yun Byun|Su-Jeong Min|Jae-Sung Kwon

韩国首尔延世大学牙科学院牙科生物材料与生物工程系