用于皮肤组织工程的茶树属植物银纳米粒子包覆自组装胶原生物基质

《Journal of Drug Delivery Science and Technology》：Camellia sinensis Capped Silver Nanosized Particle Integrated Self-Assembled Collagen Biomatrix for Skin Tissue Engineering

　　

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  绿色合成的银纳米粒子，可作为胶原蛋白稳定的生物相容性替代材料。
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  通过自组装工艺，利用山羊跟腱中的胶原蛋白制备出Col-TE-AgNPs支架。
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  Col-TE-AgNPs能够促进细胞黏附、增殖以及血管生成。
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  体内实验验证了该支架在皮肤伤口愈合方面的有效性。
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  经过处理的大鼠体内，Krt-10、Flg、Col-1A基因及蛋白的表达水平上升。

引言

伤口愈合是一个复杂的生物过程，为此人们研发出了多种先进生物材料，以提升皮肤再生的治疗效果。理想的生物材料应具备抗蛋白水解能力、适宜的孔隙结构以及良好的膨胀特性，这些特性有助于促进胶原蛋白的更新¹。此外，它还需能够激活细胞活性、促进血管生成、合成结缔组织和胶原蛋白，并通过补充细胞外基质来加速伤口愈合²。鉴于胶原蛋白是细胞外基质的重要组成部分，因此这类生物材料在伤口愈合领域表现出了显著效果。由于提取、纯化及加工较为简便，胶原蛋白被广泛用作各类生物医学应用中的材料，尤其是用于组织再生³。其中，胃蛋白酶可溶性的I型胶原蛋白因能保留其三螺旋结构且免疫原性较低，而被广泛应用于医学领域⁴。此外，它还能天然促进细胞增殖与迁移，而这些过程对于个体生长和伤口修复而言至关重要⁵。不过，胶原蛋白在提取后会受到酶解作用的影响，同时还存在热稳定性和机械强度不足的问题⁶。因此，若要将其作为生物材料使用，就必须对其进行稳定处理。通过交联以及使原胶原分子自聚集形成有序的准六边形纤维结构，可以有效提升纤维的强度与稳定性，而这一过程可通过多种化学、物理或酶法技术实现⁷。然而，这些方法存在诸多缺陷，且只能形成二元连接结构。随着纳米技术的出现，人们开始将注意力转向纳米颗粒，因为它们可以作为多价交联剂，提供更多相互作用位点。纳米颗粒可以通过改变胶原蛋白的螺旋间及螺旋内的交联方式，从而提升其热稳定性和机械强度⁸。

在众多金属纳米颗粒中，银纳米颗粒（AgNPs）因其在药物递送、伤口治疗、细胞分子成像方面的应用，以及具备的抗菌、抗炎性能而得到广泛使用⁹。但有研究指出，用硼氢化钠、柠檬酸钠、多元醇等物质化学合成银纳米颗粒时，其毒性相对更高。因此，人们开始转向利用微生物和植物提取物等绿色合成方法。

与通过微生物合成的方法相比，利用植物提取物合成银纳米颗粒更具优势，因为它成本更低、效率更高、更加环保、易于操作，无需复杂流程，而且植物提取物中含有多种次生代谢物¹⁰。茶树（Camellia sinensis (L.) Kuntz.）、辣木（Moringa oleifera Lam.）、印楝（Azadirachta indica A. Juss.）、大蒜（Allium sativum L.）、姜黄（Curcuma longa L.）、葫芦巴（Trigonella foenum-graecum L.）、合欢（Clitoria ternatea L.）、黑茄（Solanum nigrum L.）等植物的提取物都被用于银纳米颗粒的合成。这些植物来源的生物活性成分可在纳米颗粒合成过程中起到还原剂和封端剂的作用¹⁷。与化学合成的银纳米颗粒相比，绿色合成的银纳米颗粒能提高细胞的存活率，因此更适用于生物医学领域，尤其是伤口愈合方面¹⁸。考虑到茶树提取物在伤口愈合过程中的作用，本研究便采用了该提取物来制备银纳米颗粒。茶树提取物中的儿茶素、表没食子儿茶素以及表没食子儿茶素-3-没食子酸酯等水溶性植物营养素，既可以作为还原剂，又能起到稳定作用，从而帮助形成纳米颗粒¹⁹。此外，它们还是一种环保且无毒的封端剂，被认为具有显著的效果且不可或缺²⁰、²¹。银纳米颗粒本身所具备的修复特性，为皮肤伤口愈合提供了新的治疗思路²²。

本研究旨在开发用于皮肤伤口愈合的胶原蛋白基生物材料。为此，首先从山羊跟腱中提取胶原蛋白，随后将其与用茶树提取物合成的银纳米颗粒结合，制成兼具植物营养素、金属纳米颗粒以及天然聚合物特性的生物材料。此外，本研究还重点探讨了绿色合成的银纳米颗粒对胶原蛋白支架性能的影响，从而为促进伤口愈合的细胞活动提供适宜的载体。

章节要点

材料

氢氧化钠颗粒、硝酸银（AgNO₃）、牛血清白蛋白（BSA）、双氰胺酸（BCA）、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）、胎牛血清（FBS）、杜尔贝克改良伊格尔培养基（DMEM）以及各类抗生素均购自美国Sigma Aldrich公司。瑞士3T6成纤维细胞系则来自印度马哈拉施特拉邦浦那的国家细胞科学中心（NCCS）。一抗和二抗则购自Santa Cruz公司。

紫外-可见光谱分析

TE-AgNPs是通过氧化还原法合成的，其形成过程会伴随颜色由浅黄色立即变为黑色。在pH值为10时，可观察到位于420nm处的明显尖锐表面等离子体共振峰。在碱性条件下，茶树提取物中的多酚类化合物中的羟基发生去质子化反应，从而使Ag+转化为AgNPs³⁸。多酚类化合物含有大量羟基，其上的孤对电子可以与银离子发生相互作用。

圆二色光谱测定

通过圆二色光谱测定，可以记录摩尔椭圆率的变化，从而分析纳米颗粒对胶原蛋白结构稳定性的影响⁴⁵。对照组胶原蛋白、Col-AgNPs-25以及Col-TE-AgNPs-25对应的光谱分别在219nm、220nm、221nm处出现正峰，而在198nm、196nm、197nm处出现负峰。如图4A所示，对照组胶原蛋白、Col-AgNPs-25以及Col-TE-AgNPs-25在213nm处都出现了光谱交叉现象。Rpn是指正峰与

结论

本研究旨在通过引入绿色合成的银纳米颗粒（TE-AgNPs），开发基于胶原蛋白的材料，以此提升胶原蛋白的稳定性，同时避免产生可能影响伤口愈合过程中细胞活动的毒性。利用茶树提取物进行银纳米颗粒的绿色合成，大大降低了其毒性，因为茶树提取物中的多酚类化合物能够形成一层涂层，起到封端和稳定作用。

CRediT作者贡献说明

Kiruba Kannan：撰写原始稿件、数据处理与分析、可视化呈现、方法设计、研究实施、数据整理。 Manikantan Syamala Kiran：结果验证、资源协调、数据分析。 Rachita Lakra：撰写审稿与编辑稿件、可视化呈现、结果验证、研究监督、资源协调、研究实施、资金申请、数据分析、概念构建。

未引用参考文献

(56)、(57)。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

作者感谢印度泰米尔纳德邦金奈市科学与工业研究委员会以及中央皮革研究所的负责人，为该项研究提供了必要的实验条件。同时，作者也要感谢CLRI的CATERS团队在物理化学特性分析方面给予的及时帮助。这项研究是第一作者在印度科学创新研究院的博士研究项目的一部分。此外，作者还要感谢SERB机构的支持。

Kiruba Kannan|Manikantan Syamala Kiran|Rachita Lakra