在炎症条件下，使用富血小板血浆（PRP）、可注射型富血小板纤维蛋白（i-PRF）和浓缩型富血小板纤维蛋白（C-PRF）培养牙髓细胞的再生潜力：一项比较分析

《Journal of Endodontics》：Regenerative potential of dental pulp cells cultured under inflammatory conditions using platelet-rich plasma (PRP), injectable platelet rich fibrin (i-PRF), and concentrated platelet-rich fibrin (C-PRF): a comparative analysis

　　

摘要

引言

近年来，各种自体血小板浓缩物在组织再生领域的应用引起了广泛关注。本研究旨在探讨三种制备血小板浓缩物的方法，并检测其在正常及炎症环境（由大肠杆菌LPS诱导）下培养的人牙髓细胞的功能表现。

方法

人牙髓细胞在三种不同的培养基中培养：1）PRP（先以900 RCF离心5分钟，再以2000 RCF离心15分钟）；2）i-PRF（以700 RPM离心3分钟）；3）C-PRF（以2000 RCF离心8分钟），这些培养均在正常和炎症条件下进行。细胞迁移能力通过划痕试验和转孔试验检测，细胞增殖情况则通过EdU染色和Ki67免疫荧光法分析。人牙髓细胞的分化程度通过阿尔izarin Red染色、DSPP染色以及编码DMP1、DSPP和COL1A1的基因来评估。此外，处于炎症环境中的牙髓细胞还检测了编码P65和IL-1B的基因表达情况。

结果

所有血小板浓缩物组均能促进细胞迁移和增殖，其中C-PRF的效果最为显著。PRP和i-PRF可适度增加矿化结节形成及成牙标志物的表达，而C-PRF在阿尔izarin Red染色以及DMP1、DSPP、COL1A1基因表达方面的提升效果最为明显。尽管LPS诱导的炎症环境会升高IL-1B和P65的水平并降低人牙髓细胞的分化程度，但使用血小板浓缩物后各项指标均有改善，其中C-PRF组在减轻LPS/炎症带来的负面效应方面效果最佳。

结论

综上所述，使用血小板浓缩物可提升人牙髓细胞的体外活性，其中C-PRF组的效果最优。值得注意的是，虽然LPS处理的培养基通常会加剧牙髓细胞的炎症反应，但各类血小板浓缩物，尤其是C-PRF，都能在一定程度上缓解这一影响。未来需要通过更大规模的动物实验和临床研究进一步验证这些结论。

引言

自体血小板浓缩物因能够提供高于生理水平的血小板、白细胞及生长因子浓度，已被广泛应用于再生医学和口腔科领域超过30年（1, 2, 3）。血小板丰富血浆是第一代血小板浓缩物（4），此后在众多医学领域中被广泛研究并取得了良好的临床效果（5, 6）。但由于PRP需要使用抗凝剂，后续研究便开发出了血小板丰富纤维蛋白，即第二代血小板浓缩物——它能够促进更自然的凝血过程，并实现生长因子的持续释放（8）。各类血小板浓缩物的共同目标都是在局部微环境中输送高于生理水平的自体细胞和生长因子，从而加速伤口愈合（12）。

有趣的是，2014至2018年的研究表明，通过采用所谓的“低速离心技术”，可以降低离心速度，进而提高PRF的浓度（13, 14）。进一步使用更多疏水性的PET塑料管后，首次实现了无需抗凝剂的液态注射用PRF（i-PRF）的制备（14）。这种液态物质含有尚未转化为纤维蛋白的液态纤维蛋白原和凝血酶，最初是通过700 RPM离心3分钟的方案制备的（14）。这样一来，临床医生可以快速获取这种液态PRF层，有大约15分钟的时间将其注入关节或与骨移植等生物材料混合，从而促进伤口愈合（14, 16, 17）。最近有一项系统评价总结了所有医学领域中关于血小板丰富血浆与注射用血小板丰富纤维蛋白效果对比的研究证据（5），结果表明，与PRP相比，PRF具有更高的血小板浓度，且能更持久、更长期地释放生长因子，因此在众多临床前和临床研究中，都能带来更好的组织再生效果，涉及皮肤、软骨、牙周组织、骨骼、软组织以及牙髓等多个领域。

2019年，我们的研究团队研究了用于制备PRF的水平离心技术，发现与传统的固定角度离心装置相比，该技术能使细胞浓度提高4倍（18）。此外，我们还测试了24种不同转速和离心时间的水平离心方案（19），发现更高的离心速度更能将细胞富集到缓冲层中（20）。基于这些研究结果，我们开发出了浓缩血小板丰富纤维蛋白，这是一种改进型的PRF制备方法，旨在进一步提高血小板和白细胞的浓度，同时增强再生因子和免疫调节因子的有效性。与PRP和i-PRF相比，C-PRF在缓冲层附近具有更高的细胞浓度，因此能为组织修复提供更为理想的自体微环境。

因此，本研究首次探讨了在正常和炎症环境下，新型C-PRF方案与常规PRP及i-PRF对人牙髓细胞迁移、增殖、分化以及基质合成能力的影响。我们假设，由于C-PRF含有更丰富的血小板成分，且具备更多的再生因子和免疫调节因子，因此其对人牙髓细胞的再生和免疫调节作用会强于常规的PRP和i-PRF。

章节节选

PRP、i-PRF和C-PRF的制备，以及由它们衍生的培养基

在获得所有受试者的书面知情同意后，我们从6名年龄在25至35岁之间的健康志愿者身上采集了全血。入选标准为无血液系统疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病或系统性炎症疾病的健康志愿者。那些近期服用过抗生素、抗炎药、抗凝剂或其他已知会影响血小板功能的药物的志愿者未被纳入研究。

PRP、i-PRF和C-PRF对细胞迁移的影响

为了比较这三种血小板浓缩物释放的生长因子水平，我们通过ELISA方法检测了PRP、i-PRF和C-PRF培养基中TGF-β1和PDGF-AA的浓度。结果显示，C-PRF培养基中的TGF-β1和PDGF-AA浓度显著更高（图1A、B）。这些数据表明，C-PRF释放的代表性生物活性生长因子水平高于PRP和i-PRF。

为探究PRP、i-PRF和C-PRF对人牙髓细胞迁移的影响，我们进行了

讨论

据笔者所知，这是首项比较C-PRF与常规PRP及i-PRF对人牙髓细胞生物学作用的研究。总体而言，先前的研究已经证明，与PRP相比，液态i-PRF在促进人类牙龈成纤维细胞、成骨细胞及其他类型细胞的迁移、增殖和分化，以及释放促再生生长因子方面具有优势（14, 21, 22, 23, 24, 25）。这一结论与

结论

本研究考察了三种不同类型的血小板浓缩物对人牙髓细胞的影响。包括PRP、i-PRF和C-PRF在内的所有处理组都表现出优异的生物相容性及细胞活性，其中C-PRF组在细胞迁移、增殖能力方面均显著优于对照组，其人牙髓细胞的分化程度也约为对照组的2倍。据笔者所知，这也是首项研究这三种血小板浓缩物在炎症环境中的作用的研究。

作者贡献

田迪铎：实验执行、方法设计、研究实施、数据分析。帅云杰：数据收集、实验执行、数据分析、文章撰写。魏岩、柴继华：方法设计、研究实施。Richard J. Miron：方法设计、数据分析、研究实施、监督指导、文章撰写。张玉峰：数据分析、监督指导、项目管理、实验装置准备。裴飞：概念构思、方法设计、实验设计、数据分析、文章撰写。

致谢

本研究得到了武汉大学口腔医学院跨学科研究项目（项目编号：XNJC202302）的支持。此外，费飞的研究工作还获得了湖北省自然科学基金（项目编号：2024AFB701）的资助。

田迪铎|帅云杰|魏岩|柴继华|Richard J. Miron|张玉峰|裴飞

中国武汉，武汉大学口腔医学院及附属医院，口腔颌面重建与再生国家重点实验室、教育部口腔生物医学重点实验室、湖北省口腔医学重点实验室