粘菌素使用农场中携带mcr基因的大肠杆菌的高流行率及共携带mcr1、blaCTX-M55和qnrS1质粒的检测

《Journal of Global Antimicrobial Resistance》：High prevalence of mcr-carrying Escherichia coli in colistin-use farms and detection of co-carrying mcr-1, blaCTX-M-55, and qnrS1 plasmids

　　

目的：产粘菌素耐药性的大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）在食用动物中的出现对全球公共卫生构成威胁。研究人员旨在确定从粘菌素使用和非使用猪场分离的携带可移动粘菌素耐药基因（mcr）的大肠杆菌的流行率和分子特征。方法：采用肉汤微量稀释法评估从猪粪便（n=334）及其农场环境（n=218）中分离的552株大肠杆菌的抗菌药物敏感性。通过聚合酶链反应（PCR）、多位点序列分型（MLST）和下一代测序（NGS）确定粘菌素耐药大肠杆菌的分子特征。结果：在4.7%（26/552）的分离株中检测到粘菌素耐药大肠杆菌，其中猪粪便来源为6.3%（21/334），农场环境来源为2.3%（5/218），且粘菌素使用农场的检出率显著更高（p<0.05）。在所有分离株中，除一株携带mcr₃外，其余均携带mcr₁。研究人员发现61.5%的分离株通过接合将mcr₁转移至大肠杆菌J53。在携带mcr₁的质粒中，IncI2复制子类型（57.7%）占主导地位。常见克隆为ST101、ST10和ST88，在不同农场中均发现相同的序列型（STs），提示存在克隆传播。NGS分析揭示了mcr₁、blaCTX-M⁵⁵和qnrS₁基因共存于大质粒上。这些质粒还携带氨基糖苷类、β-内酰胺类、磺胺类、苯丙醇类和四环素类耐药基因。在blaCTX-M⁵⁵的遗传环境中鉴定出转座元件IS26、ISEcp1和orf477。结论：猪场中mcr₁的显著发生率可能归因于粘菌素的使用、耐药基因的克隆传播和水平传播。因此，谨慎使用抗菌药物和采取生物安全措施对于预防猪场抗菌药物耐药性至关重要。

论文解读文章

**研究背景与问题**

粘菌素（colistin）作为多黏菌素类抗生素，在猪生产中被广泛用于断奶、生长、育肥和妊娠等多个阶段，以治疗由大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）引起的腹泻。然而，粘菌素的过度使用和滥用导致携带可移动粘菌素耐药基因（mobilized colistin resistance, mcr）的大肠杆菌菌株在猪群中流行率增加，其中mcr₁最为常见。尽管已有全球性研究报道了mcr₁携带质粒的优势，但即使在未使用粘菌素的猪场，其他抗菌药物的使用也可能通过共选择间接促进mcr基因的传播。此外，mcr携带的大肠杆菌不仅可在猪间传播，还能在农场环境中持久存在，通过直接接触或排泄物污染环境表面（如地板、通风系统）成为感染源。在韩国，自2020年首次报道以来，已有多项研究关注猪源mcr携带大肠杆菌的流行情况，但关于粘菌素使用与否、不同年龄猪群及其农场环境中的流行率信息仍十分有限。因此，本研究旨在阐明2022-2023年韩国粘菌素使用与非使用猪场中猪及其农场环境分离的粘菌素耐药大肠杆菌的流行率及分子特征。

**研究内容与结论**

研究人员从韩国17个猪场（2个粘菌素使用农场，15个非使用农场）采集了585份样本（猪粪便n=354，农场环境n=231），分离出552株大肠杆菌。通过选择性培养、药敏试验、聚合酶链反应（PCR）、多位点序列分型（MLST）、接合试验及下一代测序（NGS）等技术，系统分析了粘菌素耐药大肠杆菌的流行率、耐药基因谱、质粒特征、克隆关系及遗传环境。研究得出以下主要结论：粘菌素使用农场的粘菌素耐药大肠杆菌流行率显著高于非使用农场；mcr₁为主要耐药基因，部分菌株共携带blaCTX-M⁵⁵和qnrS₁；质粒可转移，IncI2复制子类型占主导；常见克隆ST101、ST10和ST88在不同农场和环境中均被发现，提示克隆传播；NGS揭示了大质粒（约288-382 kb）上mcr₁、blaCTX-M⁵⁵和qnrS₁基因的共存，且质粒结构与人类和其他动物来源的质粒高度相似。该研究首次在韩国报道了共携带mcr₁、blaCTX-M⁵⁵和qnrS₁的质粒，并强调了抗菌药物使用压力、克隆传播和水平传播在耐药性出现中的关键作用。论文发表在《Journal of Global Antimicrobial Resistance》。

**关键技术方法**

本研究样本来源为2022-2023年韩国17个猪场（2个粘菌素使用农场，15个非使用农场）的猪粪便（n=334）和农场环境（n=218，包括地板、通风系统、饲料和饮水）。主要技术方法包括：采用含粘菌素（2 μg/mL）的MacConkey琼脂进行选择性分离，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）鉴定大肠杆菌；使用肉汤微量稀释法测定抗菌药物敏感性；通过多重PCR和测序检测mcr、超广谱β-内酰胺酶（ESBL）基因（blaCTX-M、blaCMY）、质粒介导的喹诺酮耐药（PMQR）基因（qnrS）及喹诺酮耐药决定区（QRDR）突变（gyrA、parE）；通过滤膜接合试验评估mcr基因的可转移性，并利用PCR进行质粒复制子分型；通过MLST分析克隆关系；对4株菌进行NGS（Illumina NovaSeq 6000和Oxford Nanopore MinION），并使用Unicycler、Prokka、ResFinder、PlasmidFinder、ISFinder等工具进行基因组组装、注释和耐药基因、移动遗传元件分析。

**研究结果**

**3.1 粘菌素耐药大肠杆菌的流行率**

通过选择性培养和药敏试验，研究人员发现粘菌素耐药大肠杆菌总检出率为4.7%（26/552），其中猪粪便来源为6.3%（21/334），农场环境来源为2.3%（5/218）。粘菌素使用农场的猪粪便和环境样本检出率（37.5%和11.5%）显著高于非使用农场（2%和1%）（p<0.05）。不同年龄猪群中，断奶仔猪的检出率最高（12.9%），其次为生长猪（4.8%）、育肥猪（6.3%）和母猪（1.2%）。环境样本中，地板和通风系统检出率较高，饲料和饮水未检出。结果表明，粘菌素使用是耐药菌流行的关键风险因素，且断奶仔猪为主要携带群体。

**3.2 粘菌素耐药大肠杆菌的特征**

通过PCR和测序，26株粘菌素耐药大肠杆菌中，25株携带mcr₁，1株携带mcr₃，所有菌株对粘菌素的最小抑菌浓度（MIC）为4-16 μg/mL。此外，这些菌株普遍对氯霉素、链霉素和四环素等多种抗菌药共耐药。在第三代头孢菌素耐药菌株中鉴定出blaCTX-M⁵⁵和blaCTX-M⁶⁵；8株环丙沙星耐药菌株携带gyrA突变（S83L和D87N），其中2株MIC≥16 μg/mL的菌株还伴有parE突变（S458A）。值得注意的是，50%（13/26）的菌株携带PMQR基因qnrS。通过接合试验，61.5%（16/26）的菌株可将mcr₁转移至大肠杆菌J53，其中5株还共转移了氯霉素、四环素、庆大霉素和链霉素耐药。质粒复制子分型显示，转移质粒中IncI2占主导（57.7%），部分还检测到X4、A/C和F型。MLST分析共鉴定出11个序列型（STs），其中ST101（n=6）、ST10（n=5）和ST88（n=4）占58%。相同ST（如ST88和ST101）在不同农场及猪与环境样本中同时出现，提示克隆传播。

**3.3 下一代测序分析**

对4株携带mcr₁和blaCTX-M⁵⁵的菌株（3株ST88，1株ST224）进行NGS，发现所有菌株均携带大型质粒（约288-382 kb），属于IncHI2不相容群。这些质粒共携带多种耐药基因：β-内酰胺类（TEM-1、TEM-135、CTX-M⁵⁵）、氨基糖苷类（aph(6)、aph(3)、aadA22、aac(3)）、磺胺类（sul3）、苯丙醇类（floR）、四环素类（tet(A)）和粘菌素（mcr₁）。在blaCTX-M⁵⁵的上游检测到ISEcp1和IS26，构成典型的ISEcp1-blaCTX-M⁵⁵转座单元（含ISEcp1、blaCTX-M⁵⁵、orf477和IncA/C骨架的112 bp片段）。mcr₁基因周围存在ISApl1移动元件。与人类和其他动物来源的质粒（如CP180633.1、CP194150.1、CP195582.1等）比较显示，这些质粒在大小、编码序列和耐药基因组成上高度相似，进一步支持了质粒跨物种传播的潜力。

**总结与结论**

讨论部分指出，粘菌素使用农场中耐药菌流行率显著更高，但非使用农场也存在低水平耐药，可能源于其他抗菌药物的共选择压力。环境样本（如通风系统和地板）中检出耐药菌，表明环境持久性和传播风险。mcr₁的高可转移性及其与其他抗菌药耐药基因的共转移，解释了多重耐药菌株的出现。ST101、ST10和ST88为全球常见克隆，在猪和环境中的一致性提示克隆传播。质粒上mcr₁、blaCTX-M⁵⁵和qnrS₁的共存首次在韩国报道，且转座元件（ISEcp1、IS26、orf477）促进了blaCTX-M⁵⁵的传播。研究结论如下：在粘菌素使用农场中观察到粘菌素耐药大肠杆菌的高发生率，其中mcr₁是主要的mcr基因。此外，ST101、ST10和ST88是最常鉴定的序列型，在猪和农场环境中发现相似的克隆。在大肠杆菌质粒中检测到mcr₁、blaCTX-M⁵⁵和qnrS₁基因的共存。此外，位于blaCTX-M⁵⁵遗传环境中的移动遗传元件ISEcp1、IS26和orf477促进了耐药性的传播。这些发现表明，抗菌药物使用压力以及耐药基因的克隆和水平传播是猪群中出现粘菌素耐药大肠杆菌的风险因素。因此，为减轻耐药性，限制抗菌药物使用并在猪场实施适当的卫生措施至关重要。