在N,N-二甲基甲酰胺双重胁迫下厌氧氨氧化作用中的氮代谢与微生物反应

《Journal of Hazardous Materials》：Nitrogen metabolism and microbial responses in anammox under dual stress of N,N-dimethylformamide

　　

摘要

N,N-二甲基甲酰胺（DMF）是一种常见的有毒工业溶剂。它常随低C/N比且高NH₄⁺-N含量的废水进入系统，给厌氧氨氧化过程带来有机物和毒性双重压力。然而，其长期影响机制及微生物反应模式仍不明确。本研究探讨了不同浓度DMF对厌氧氨氧化系统氮去除效率、氮转化途径、细胞生理状态、微生物群落演变以及功能基因表达的影响，并评估了系统的恢复潜力。研究结果表明，低浓度DMF作为有机物可提升厌氧氨氧化系统的氮去除效率。但该物质难以被相关异养细菌快速降解，其积累会对厌氧氨氧化细菌产生显著毒性作用，半抑制浓度为10.26?mg/L。低浓度DMF会轻微促进胞外聚合物分泌和抗氧化酶活性；而高浓度DMF则会引发活性氧爆发，抑制超氧化物歧化酶活性，破坏细胞膜结构，降低ATP含量，进而导致能量代谢紊乱。随着DMF浓度升高，Candidatus_Brocadia和的相对丰度先上升后下降，而的相对丰度则持续减少。厌氧氨氧化细菌的核心基因（hzsA/B/C、hdh）以及自养碳固定途径的基因表达水平下降，而异养反硝化相关基因则上升，使得氮去除途径从自养过程转向异养反硝化。停止添加DMF后，厌氧氨氧化系统的反硝化性能、群落结构及功能基因表达有所恢复。

引言

N,N-二甲基甲酰胺（DMF）作为一种典型的极性非质子溶剂，因其优异的溶解性和化学稳定性，被广泛应用于化学工程、制药、合成皮革等行业，年消耗量达122万公吨[1]。这就导致了大量含氮废水进入工业废水处理系统。DMF是一种有毒有机化合物，常规微生物难以快速将其矿化[2]。由于其强亲脂性和渗透性，它能轻易穿透细胞膜，对传统生物处理系统构成严重威胁[3]。目前，通常采用化学氧化与高级生化处理相结合的方法来去除DMF，且已分离出多种专性降解微生物用于此目的[4]。然而，仅依靠厌氧消化等生化处理方法难以实现DMF的完全降解，而且水质波动容易打破后续的多级硝化/反硝化氮去除过程[2]。经过预处理后，DMF废水具有低C/N比和高NH₄⁺-N浓度的特点。传统的氮去除工艺存在能耗高、化学品使用量大以及产生的污泥过多的问题。

厌氧氨氧化技术作为一种高效且可持续的生物氮去除技术，无需外部碳源，且产生的剩余污泥较少。这些优势使其成为处理高NH₄⁺-N负荷、低C/N比的废水的理想选择[5]、[6]。不过，引入厌氧氨氧化过程的有机化合物往往会产生两相反应：在微量时能促进氮的去除，而在较高浓度时则会抑制其活性[7]、[8]。低浓度的有机物可作为电子供体，激活与厌氧氨氧化系统相关的异养细菌，通过“部分反硝化-厌氧氨氧化”形成异养-自养耦合的代谢生态系统，从而减少厌氧氨氧化代谢产生的NO₃^--N，提高整体氮去除效率[9]。厌氧氨氧化细菌的倍增时间较长，且对环境变化较为敏感[10]、[11]、[12]。过量的有机物会促进NO₂^--N的还原，导致其与厌氧氨氧化细菌争夺电子受体和生存空间，进而降低氮去除效率[13]、[14]。进入系统的有毒物质还会在微生物体内引发氧化应激反应[15]。过量的活性氧会攻击细胞结构，可能导致厌氧氨氧化体膜发生脂质过氧化，进而破坏细胞内的ATP能量代谢系统[16]。DMF兼具有机底物和有毒物质的特性，但其对厌氧氨氧化系统的影响尚未得到充分研究。目前仅有Nakamura等人[17]通过短期批次实验证实了DMF对厌氧氨氧化的毒性抑制作用。关于厌氧氨氧化系统宏观层面氮去除性能的变化规律，仍存在理论空白。物理化学屏障的作用，尤其是胞外聚合物的反应机制，尚未完全明确。在微观层面，包括活性氧生成、抗氧化酶防御作用以及能量重新分配机制在内的细胞生理状态也缺乏系统研究。此外，在应力作用下微生物群落结构演变的多元动态耦合机制也尚不清晰。尤其是在严重DMF毒性胁迫后，系统生理功能与群落生态的恢复轨迹也不明确。因此，了解DMF影响厌氧氨氧化系统的机制，对于拓展该技术的应用范围具有重要的实际意义。

本研究采用了装有成熟厌氧氨氧化颗粒污泥的上流式厌氧污泥床反应器，逐步提高进水中的DMF浓度，以全面评估其对厌氧氨氧化系统的影响。主要研究内容包括：（1）不同DMF浓度对厌氧氨氧化系统氮转化途径及氮去除效率的影响；（2）厌氧氨氧化系统在梯度DMF胁迫下的应激响应机制，包括EPS组成的动态变化、细胞内活性氧水平的波动，以及关键抗氧化酶和细胞能量载体ATP的反应；（3）分析不同DMF浓度下厌氧氨氧化系统中功能微生物群落的演变及基因表达情况；（4）受抑制的厌氧氨氧化系统能否恢复氮去除性能。通过对DMF胁迫下厌氧氨氧化系统结构-功能关系变化及其路径重构的分析，揭示了其“低刺激高抑制”反应的微观机制，为设计能够处理含有复杂有毒有机溶剂的髙氨氮工业废水的生物处理工艺、调控微生物耐受性以及实现稳定运行提供了有力的理论支持和科学指导。

章节节选

实验装置

本研究使用的厌氧氨氧化系统为3升上流式厌氧污泥床反应器，该反应器配备了三相分离器和顶部搅拌装置，搅拌转速为60?r/min（见图1）。模拟废水从反应器底部进入，经过反应区和三相分离器后，最终从反应器顶部的出水口流出。反应器外还包裹有水浴加热系统，用于维持反应条件。

DMF浓度对厌氧氨氧化系统中氮转化的影响

在无DMF的启动阶段（第1–19天），进水中NH₄⁺-N和NO₂^--N的含量分别保持在102?±?11?mg/L和122?±?8?mg/L。在此期间，出水中的相应浓度从初始的25?mg/L和17?mg/L逐渐下降至8?±?5?mg/L和6?±?3?mg/L（见图2a）。而出水中的NO₃^--N浓度则维持在23?±?6?mg/L的水平。TNRE和TNRR的平均值分别为81?±?9%和1.43?±?0.18?kg/(m³·d)，表明系统的自养氮去除性能十分稳定且强劲（见图2b）。

结论

本研究首次发现，与厌氧氨氧化系统相关的异养微生物难以快速降解DMF，从而导致其在系统中积累。DMF由此从有机底物转变为有毒胁迫因子。当进水中的DMF浓度达到100.6?mg/L时，厌氧氨氧化系统的氮转化途径会从自养过程转变为异养反硝化。在所研究的条件下，DMF对厌氧氨氧化系统的半抑制浓度为10.26?mg/L。

作者贡献说明

Yao Xu：方法设计、实验研究。Yayi Wang：方法设计、实验研究、概念构建。Yong Huang：结果可视化、项目监督。Han Wang：实验研究、定量分析。Anni Zhang：实验研究、数据整理。Yujie Hua：初稿撰写、数据整理、概念构建。Yan Yuan：论文润色、资金申请、数据整理、概念构建。Xiang Li：论文润色、结果可视化、项目监督、数据整理、概念构建。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划的支持（项目编号：2023YFC3206903）。

Yujie Hua|Anni Zhang|Xiang Li|Yan Yuan|Yayi Wang|Yao Xu|Han Wang|Yong Huang

中国苏州215009，苏州科技大学环境科学与工程学院