鸡羽斑驳表型表现出遗传异质性，并由EDNRB2位点突变所致

《Animal Genetics》：The Mottling Phenotype in Chickens Shows Genetic Heterogeneity and Is Caused by Mutations at the EDNRB2 Locus

　　

斑驳（mottling）是一种广泛存在于全球多种家鸡品种中的羽内花纹，并以常染色体隐性性状方式遗传。此前研究曾报道，EDNRB2基因中的Arg332His氨基酸替换是若干日本鸡品种斑驳表型的致因变异。本研究表明，该替换并非起源于法国的Houdan斑驳鸡（Mottled Houdan）斑驳表型的致因突变。通过连锁定位（linkage mapping），研究人员证实，包含EDNRB2基因的230 kb区域与斑驳表型存在强关联。随后利用全基因组测序（whole genome sequencing, WGS）对该区域内的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）、插入缺失（insertions and deletions, indels）及结构变异（structural variants, SVs）进行筛查，发现EDNRB2的错义突变Ala228Thr在Houdan斑驳鸡及另外3个斑驳品种中呈完全关联。该突变在一个针对该表型发生分离的实验鸡系中也与斑驳表型相关。此外，研究人员还记录到杂合个体中EDNRB2存在显著等位基因表达失衡（allelic imbalance），提示调控性突变也可能参与斑驳表型的形成。然而，在所有斑驳品种中，并不存在任何单一突变与斑驳表型完全一致共分离，这为该位点的遗传异质性提供了证据。研究人员据此提出，鸡斑驳表型至少由3种不同等位基因所致。研究结果为不同家鸡品种中斑驳等位基因的平行演化（parallel evolution）提供了实例。

该文发表于《Animal Genetics》，围绕家鸡斑驳羽色（mottling）的分子遗传基础展开，核心结论是：鸡的斑驳表型并非由单一致因突变所解释，而是在EDNRB2位点存在显著遗传异质性，不同品种可能携带不同的致因等位基因。研究以法国起源的Houdan斑驳鸡为主要对象，针对既往在日本鸡中提出的EDNRB2 Arg332His错义突变是否具有普适致因作用进行了系统检验。结果显示，Houdan斑驳鸡并不携带该候选致病变异，从而提出一个关键问题：不同鸡种中外观相似的斑驳表型，是否具有不同的遗传来源。正是由于传统遗传学已证明斑驳为常染色体隐性性状，且不同品种间还存在与三色羽型相关的等位关系，而分子层面的统一解释尚不充分，因此开展该研究具有重要意义。该研究不仅有助于解析羽色花纹形成机制，也为鸟类色素细胞迁移、分化与局部缺失的发育遗传学研究提供了模型。

在研究设计上，研究人员首先构建了Mottled Houdan×Black Langshan回交家系，并利用SNP芯片与连锁分析将MO位点定位至4号染色体上一个230 kb候选区间，该区间包含EDNRB2及另外7个基因。随后结合多品种全基因组测序（WGS）数据，对该区域内SNP、indel和SV进行系统筛查，并通过相同祖源区段（identical-by-descent, IBD）分析比较多个斑驳或三色品种之间是否共享致因单倍型。研究进一步在独立实验群体及多品种面板中对候选突变进行诊断性分型验证，并通过等位基因表达失衡分析，检测EDNRB2是否还存在顺式调控（cis-regulatory）层面的表达差异。最终，研究人员提出：Ala228Thr是若干非日本黑色斑驳品种中的强候选致因突变，而日本斑驳鸡及其他三色品种则很可能由不同突变引起，说明该表型在EDNRB2位点发生了平行演化。

主要技术方法方面，研究基于两个实验资源和一个多品种比较框架开展：其一，利用Mottled Houdan×Black Langshan回交家系（221只）进行60 K SNP芯片池化分型（SNP-MaP）和两轮连锁定位；其二，利用来源于Houdan、Gournay及公开数据库的全基因组测序样本，结合变异检测、IBD区段识别和遗传距离树分析筛选候选突变；其三，在INRAE保种分离系和73个群体/品系样本中实施KASP、焦磷酸测序及Sanger测序，并在Houdan×Black Silkie的F₁个体皮肤和发育中羽囊样本中开展EDNRB2等位基因表达失衡检测。

2.1 Assignment of MO to the EDNRB2 Genomic Region Using SNP Analysis and Linkage Mapping
研究人员构建了Mottled Houdan（MO*MO/MO）×Black Langshan（MO*N/N）回交家系，回交后代中斑驳个体与黑羽个体比例符合1:1分离预期，支持该表型的单基因隐性遗传模式。通过60 K SNP芯片对斑驳与黑羽后代DNA池进行全基因组扫描，在4号染色体发现显著信号峰。进一步个体分型和两轮连锁分析将候选区域由10.80 Mb逐步缩小至230 kb。该区间包含EDNRB2，因此EDNRB2成为最主要候选基因。该部分结果通过经典遗传定位证明，Houdan鸡斑驳表型的致因变异位于EDNRB2附近，而非其他远端基因组区域。

2.2 Identification of Sequence Variants Associated With MO in Non-Japanese Black Mottled Breeds
在定位结果基础上，研究人员整合9个斑驳品种的18份样本WGS数据，希望寻找所有斑驳鸡共同共享的IBD区段及共同致因突变。然而结果并未发现一个由所有斑驳品种共同拥有的IBD区段，也未发现一个在全部斑驳群体中完全一致的候选突变。这一结果直接提示斑驳表型在分子基础上存在遗传异质性。进一步利用遗传距离树分析，研究人员将18份斑驳样本划分为6个子集，并在“非日本黑色斑驳”子集，即Houdan、Gournay、Mottled Java及冰岛本地斑驳鸡中识别到一个20 kb的IBD区段（IBD1）。在该区段内，共筛得11个候选变异，其中位于EDNRB2第5外显子的rs313943998为唯一编码区变异，对应Ala228Thr错义替换。该位点保守性高（PhyloP=6.26），并且在195份非斑驳样本中参考等位基因固定，因而被认为是该类非日本黑色斑驳鸡最强的候选致因突变。

研究人员同时考察了三色Booted Bantam样本，识别出4个可能的IBD区段（IBD2–IBD5），并从中筛得12个候选SNP，但没有任何变异表现出明确的功能重要性证据。因此，虽然家系研究曾指出黑色斑驳和三色花纹在遗传上等位，但本研究并未在三色品种中找到与Ala228Thr同一的明确分子致因突变。对于日本黑色斑驳矮脚鸡、Red Spangled Orloff和Red Mottled Aseel等其他子集，由于共享IBD证据不足，现有数据尚不足以锁定其候选突变。这一部分结果说明，不同斑驳或相关三色品种在EDNRB2邻域可能分别携带不同的致因变异。

2.3 Diagnostic Tests
为验证Ala228Thr与斑驳表型的关联性，研究人员在两个独立实验群体中开展分型检测。其一是在用于定位的221只回交个体中，其二是在INRAE保留的Houdan来源分离系18只个体中。结果显示，Ala228Thr在两个群体中均与MO位点完全共分离，表明该变异与斑驳表型存在极强关联。值得注意的是，即使在Ala228Thr纯合个体间，白斑大小仍表现出明显差异，提示表型强度可能还受到其他遗传因素影响。进一步在包含5个斑驳群体和68个非斑驳群体的品种面板中进行诊断分型发现，在237只非斑驳鸡中没有发现Ala228Thr纯合子，仅存在6只杂合子；而17份Houdan斑驳样本均为Ala228Thr纯合。与此同时，这些样本在先前报道与日本斑驳相关的Arg332His位点上均固定为野生型等位基因。该结果有力证明：Houdan等欧洲黑色斑驳鸡的分子基础不同于日本斑驳鸡。

2.4 Differential Expression of EDNRB2 Alleles Implies the Presence of cis-Regulatory Mutations
为探究除编码变异外是否还存在调控变异参与表型形成，研究人员利用Mottled Houdan×Black Silkie的F₁杂合个体开展EDNRB2等位基因表达失衡实验。由于F₁个体在Ala228Thr位点为杂合状态，研究人员可据此区分两条等位基因来源。结果表明，在发育中的羽囊和皮肤组织中，野生型等位基因表达量分别约为MO等位基因的3倍和3.5倍，显示出显著等位基因表达不平衡。由于顺式调控变异会影响两条等位基因中的一条，而反式调控变异通常会同时作用于两条等位基因，因此该结果支持Houdan斑驳鸡中存在一个或多个顺式调控突变，导致EDNRB2表达下调。由此可见，Houdan斑驳表型可能并非仅由Ala228Thr单独造成，而是编码功能轻度改变与表达下调共同作用的结果。

讨论部分指出，本研究揭示EDNRB2/斑驳位点存在显著遗传异质性，至少包含3种引发斑驳表型的不同等位基因，另加此前在日本Minohiki品种中与酪氨酸酶非依赖性隐性白羽相关的Cys244Phe等位基因。研究人员认为，Ala228Thr是Houdan、Gournay、Mottled Java和冰岛斑驳鸡中最有力的候选致因变异，其位于EDNRB2蛋白第4跨膜结构域，且高度保守。结合两个独立群体中的完全关联证据及表达失衡结果，研究支持该表型可能来源于编码区错义突变与EDNRB2表达下调的联合作用。研究还将结果置于更广泛的鸟类和哺乳动物色素遗传背景中讨论，指出EDNRB2在鸟类色素细胞分化与迁移中具有核心作用，类似基因表达降低在其他鸟类局部白羽表型中也有报道，而哺乳动物中同源基因EDNRB的突变则可导致类似的花斑表型。文章进一步联系经典研究对于MO表型作用机制的解释，认为EDNRB2功能改变可能影响黑素细胞（melanocyte）在发育中羽囊中的迁移与成熟，从而形成羽尖失色和后续色带模式。

研究结论部分可译为：总之，多方面证据支持，EDNRB2的错义突变Ala228Thr可能与其表达降低共同导致Mottled Houdan、Mottled Java、Gournay及冰岛斑驳鸡中的斑驳表型。研究已经证明，其他斑驳品种，如三色Booted Bantam和Japanese Black Mottled Bantam，必然携带其他致因突变。因此，鸡的EDNRB2/斑驳位点存在明显遗传异质性，未来仍需扩大样本开展进一步研究，以揭示更多致因突变，并检验EDNRB2表达下调是否是跨品种形成斑驳表型的共同机制。