马血作为磁性纳米颗粒血栓形成潜力评估的预筛选模型

《Journal of Magnetism and Magnetic Materials》：Equine blood as a pre-screening model for the assessment of thrombogenicity of magnetic nanoparticles

　　

磁性纳米颗粒（Magnetic nanoparticles, MNPs）正被开发用于多种涉及其与血液直接接触的生物医学技术，包括磁热疗（magnetic hyperthermia）、靶向溶栓（targeted thrombolysis）和磁分离平台（magnetic separation platforms）。然而，MNPs潜在的血栓形成性（thrombogenicity）仍是一个重要的安全性问题，因为纳米颗粒的理化性质常会触发血小板和凝血因子的活化。纳米颗粒诱导凝血的实验评估通常使用新鲜捐献的人血进行，尽管获取此类生物材料可能存在物流和监管方面的挑战，尤其是在纳米颗粒开发的早期阶段。在这项工作中，研究人员探讨了使用市售马血作为人血替代物用于MNPs血栓形成性初步评估的可行性。研究人员通过铁盐共沉淀法合成了甘氨酸包被的氧化铁纳米颗粒（Iron oxide nanoparticles, IONPs），并通过透射电子显微镜（Transmission electron microscopy, TEM）、X射线衍射（X-ray diffraction, XRD）、动态光散射（Dynamic light scattering, DLS）和电泳光散射（Electrophoretic light scattering, ELS）进行理化表征。进一步使用交流磁学测量（AC magnetometry）和交流磁化率（AC magnetic susceptibility）测量评估磁行为。在再钙化马血中进行的凝血测定显示，与未处理的对照样品相比，所有合成的纳米颗粒均加速了凝块形成。重要的是，当纳米颗粒与牛血清白蛋白（Bovine serum albumin, BSA）预孵育时，这种促凝血行为在很大程度上被减弱，表明纳米颗粒表面在触发血液凝固中的影响。在马血中观察到的这些凝血趋势与使用类似纳米颗粒制剂在新鲜捐献人血中看到的已知效应密切一致。这些发现表明，在人临床前测试之前的纳米颗粒血栓形成性早期阶段筛选中，马血可能提供一个实用且可及的实验平台。

该研究发表于《Journal of Magnetism and Magnetic Materials》。磁性纳米颗粒（Magnetic nanoparticles, MNPs）在磁共振成像（Magnetic resonance imaging, MRI）对比剂、磁粒子成像（Magnetic particle imaging, MPI）、靶向给药及磁热疗（Magnetic hyperthermia, MH）等生物医学领域的应用日益广泛，其中部分技术如MH及靶向溶栓涉及MNPs与血液的直接接触。然而，MNPs的理化性质可能激活血小板与凝血因子，引发非预期的血栓形成（Thrombogenicity），这对其临床转化构成重要安全隐患。目前，依据ISO 10993-4及国际人用药品注册技术协调会（Council for Harmonisation, ICH）指南，评估MNPs血液相容性常依赖新鲜捐献的人血进行体外凝血实验，但在纳米颗粒开发早期阶段，获取人血面临伦理审批、物流运输、专业人员及成本等多重限制。尽管凝血级联反应在哺乳动物间具有高度保守性，马血含有与人血类似的凝血因子、血小板及纤维蛋白原等关键组分，且商用马血具备标准化与可及性优势，但其作为MNPs血栓形成性预筛选模型的有效性尚待验证。因此，研究人员开展此项研究，旨在评估马血能否复现人血中观察到的MNPs诱导凝血趋势及其表面介导的调控效应，为早期开发提供替代实验平台。

研究人员为开展研究采用的主要关键技术方法包括：获取商用ACD马全血（ACD horse whole blood, TCS Biosciences, UK）作为实验基质；通过共沉淀法合成甘氨酸包被的氧化铁纳米颗粒（IONPs, 批次IMO 3, 4, 5）并利用透射电子显微镜（TEM）、X射线衍射（XRD）、动态光散射（DLS）、电泳光散射（ELS）及铁嗪法（Ferrozine assay）进行理化与铁浓度表征；采用交流磁学测量（AC magnetometry）与交流磁化率（AC magnetic susceptibility）分析磁行为与比吸收率（Specific Absorption Rate, SAR）；在再钙化马血中进行凝血时间实验，通过视觉终点法记录凝块形成时间，并设牛血清白蛋白（BSA）预孵育组以评估表面钝化效应，统计学采用单因素方差分析（One-way ANOVA）与Tukey事后检验。

研究结果部分内容如下。

3.1. Physicochemical characterisation of IONPs。研究人员通过对IMO 3、IMO 4、IMO 5三个批次甘氨酸包被IONPs的表征得出，TEM显示核心尺寸分别为7.9±2.5 nm、9.6±2.5 nm、10.5±3 nm，呈不规则圆形；XRD图谱匹配磁铁矿（Magnetite）结构，Rietveld精修晶格参数略低于标准磁铁矿，提示部分氧化为磁赤铁矿（Maghemite, γ-Fe₂O₃），晶体尺寸小于TEM核心尺寸；DLS显示流体动力学直径（Hydrodynamic diameter, D_h）分别为429.6 nm、2078 nm、178 nm，多分散指数（Polydispersity index, PDI）分别为0.6、0.5、0.2；电泳光散射测得ζ电位分别为18.3±4.27 mV、7.69±3.80 mV、31.7±5.3 mV，其中IMO 5具有高ζ电位、小D_h及低PDI，胶体稳定性最佳。

3.2. AC magnetic characterisation of IONPs。研究人员通过交流磁学测量发现，在所有交变磁场（Alternating magnetic field, AMF）条件下（25 kHz和97.5 kHz，4 kA m^?1和24 kA m^?1），磁滞回线面积及比吸收率（SAR）均呈IMO 3 < IMO 4 < IMO 5的趋势，最高SAR在97.5 kHz和24 kA m^?1下IMO 5达32.9±2.6 W g^?1_Fe；交流磁化率（χ_AC）实部（χ’）与虚部（χ”）信号强度亦呈相同趋势，且虚部在1–10 kHz区域峰值可忽略，表明内禀磁弛豫机制以奈尔弛豫（Néel relaxation）为主，磁响应受颗粒间偶极相互作用调控。

3.3. Coagulation time experiments。研究人员在再钙化马血凝血实验中得出，对照组凝血时间为520±92 s，而加入IONPs后凝血时间显著缩短至IMO 3为300±60 s、IMO 4为240±60 s、IMO 5为260±35 s（p < 0.05），证实IONPs加速凝块形成；经牛血清白蛋白（BSA）预孵育处理后，各批次IONPs的促凝血效应被大幅抑制，凝血时间与对照组无显著差异（p > 0.05），表明促凝血行为主要由裸露纳米颗粒表面触发，可通过蛋白吸附物理钝化衰减。

讨论部分总结指出，研究人员合成的甘氨酸包被IONPs核心小于15 nm，具磁铁矿结构及以奈尔弛豫为主的磁行为，SAR差异与流体动力学直径及胶体稳定性相关。马血实验成功复现了此前在人血中观察到的IONPs促凝血趋势及BSA表面钝化的衰减效应，说明马血能捕获相关的纳米颗粒-血液相互作用机制。尽管马血与人血在血小板性质、纤维蛋白结构及凝块动力学上存在种间差异，但其对纳米颗粒表面属性引起的相对凝血变化具备敏感性。该研究将马血定位为进入人血研究前的预筛选工具而非直接替代物，商用马血可降低早期开发对专用设施与人血的依赖。讨论同时指出视觉凝血终点法的局限性，建议未来结合血栓弹力图（Thromboelastography, TEG）或旋转血栓弹力测定法（Rotational thromboelastometry, ROTEM）等定量技术，并扩展至血小板活化、凝血酶生成等凝血系统组分评估及多批次样本验证。

研究结论翻译为：在这项研究中，研究人员评估了使用马血作为评估MNPs血栓形成潜力的替代实验模型的可行性。研究人员探究了先前在全血（包括纳米颗粒诱导的凝血及其通过BSA进行纳米颗粒表面钝化缓解）中观察到的凝血反应是否也能在该系统中检测到。为此，研究人员合成了甘氨酸包被的IONPs并进行了理化和磁学表征，随后在凝血测定中进行评估。这使得能够评估该实验框架作为在进入新鲜捐献人全血进行进一步研究之前的潜在预筛选平台，而非人血的直接替代物。在再钙化马血中进行的凝血测定显示，与未处理对照相比，所有合成的纳米颗粒均加速凝块形成。重要的是，当纳米颗粒与BSA预孵育时，这种促凝血行为在很大程度上被减弱，表明纳米颗粒表面在触发血液凝固中的影响。这些在马血中观察到的凝血趋势与使用类似纳米颗粒制剂在新鲜捐献人血中看到的已知效应密切一致。这些发现表明，在人临床前测试之前的MNPs血栓形成性早期阶段筛选中，马血可能提供一个实用且可及的实验平台。

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