《Histopathology》：UK recommendations for Ki-67 immunohistochemical staining and interpretation in breast cancer
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Ki-67是公认的肿瘤增殖标志物，也是乳腺癌中重要的预后及预测性生物标志物，尤其在激素受体阳性（HR阳性）、HER2阴性亚型中具有关键价值。尽管其生物学意义明确，但观察者间及实验室间的变异限制了临床转化应用。近期治疗进展使得临床实践中对Ki-67准确、可重复评
Ki-67是公认的肿瘤增殖标志物，也是乳腺癌中重要的预后及预测性生物标志物，尤其在激素受体阳性（HR阳性）、HER2阴性亚型中具有关键价值。尽管其生物学意义明确，但观察者间及实验室间的变异限制了临床转化应用。近期治疗进展使得临床实践中对Ki-67准确、可重复评估的需求显著提升。本综述阐述了Ki-67作为增殖标志物的生物学基础、可靠免疫组织化学的技术要求，以及分析前与分析变量对染色质量的影响。研究人员评估了现有及新兴的评分方法，并为执业病理学家提供了评分推荐。文中提出简化的校准全局评估法，作为 exhaustive 视觉量化的替代方案，该方法在保证准确性的同时显著缩短评分时间，避免了估算法的变异性。推荐在可行时使用经验证算法的图像分析/人工智能（AI）工具。综述进一步探讨了Ki-67在新辅助内分泌及化疗疗效预测中的作用、其在术前内分泌预后指数（PEPI评分）等预后模型中的整合价值，以及在辅助性CDK4/6抑制剂（CDK4/6i）患者筛选中的应用。文章讨论了固定截断值的局限性，以及分层分类和连续建模的潜在优势。最后，研究人员概述了数字病理学与AI日益增长的作用——其已证实可提升可重复性、缩短周转时间，且预后效能优于人工评分。Ki-67是具有临床意义的生物标志物，唯有通过严格的标准化、经验证的评分方法，以及病理学家与肿瘤学家间的密切沟通，方能充分实现其价值。本指南为高质量Ki-67评估提供了实用框架，支持其安全有效地整合入当代乳腺癌全程管理。
引言
monarchE与NATALEE试验证实，细胞周期蛋白依赖性激酶4/6（CDK4/6）抑制剂可使高风险激素受体阳性（HR+）、HER2阴性早期乳腺癌患者获益，两项试验的入组标准均将Ki-67指数＞20%与其他参数联合作为筛选条件。上述试验结果及后续辅助CDK4/6抑制剂临床应用指南的发布，重新凸显了对Ki-67开展及时、可靠的常规实验室评估的需求。本文系统梳理了Ki-67免疫组织化学的临床应用场景，分析了分析前、分析及分析后变量，探讨了相关截断值的选择，并阐述了数字病理学与人工智能（AI）在Ki-67评估中的潜在价值，为病理学家提供了关于Ki-67免疫组织化学相关性、染色标准化及规范评分的指导建议。
什么是Ki-67
Ki-67是由MKI-67基因编码的核蛋白，作为生物表面活性剂在细胞分裂期分散染色体。该蛋白在细胞周期G1、S、G2及M期均有表达，其中G1、S期表达水平较低，分裂中期达峰值，后期快速降解，G0期无表达，半衰期仅60–90分钟，其各阶段含量取决于合成与降解的动态平衡，因此是理想的增殖标志物。1980年代初Johannes Gerdes首次制备出鼠抗Ki-67单克隆抗体，其命名源于德国城市基尔（Kiel）及96孔板第67孔的位置。最初该抗体仅适用于新鲜冷冻组织，1992年MIB-1抗体的问世使得Ki-67抗原可在常规石蜡包埋（FFPE）组织中检测，极大推动了其在病理科的广泛应用。
Ki-67免疫组织化学的相关性
Ki-67免疫组织化学检测用抗体
目前市售的Ki-67检测单克隆抗体主要包括MIB-1（Agilent Dako）、30-9（Roche Diagnostics）及K2（Leica Biosystems），三者在英国国家免疫组织化学与荧光原位杂交室间质评（UK NEQAS ICC & ISH）及北欧免疫组织化学质控（NordiQC）数据中的占比分别约为45%、40%及4%。所有主流抗体克隆均可实现高质量染色，但需注意抗体克隆与检测试剂及自动化平台的匹配性：K2克隆在罗氏或Dako平台上表现不佳，MIB-1克隆与Dako配套试剂及平台联用时结果最优。鉴于MIB-1在临床研究及指南中的广泛验证与稳定表现，其仍是乳腺癌Ki-67评估的首选抗体，30-9克隆也可获得满意结果，但不同克隆结果不可互换，正式使用前需完成验证。
Ki-67免疫组织化学染色模式为核染色，仅核染色纳入评分，胞质或胞膜非特异性染色无临床意义。核染色可呈均质、颗粒状或混合模式，虽颗粒状染色在一项研究中与管腔型乳腺癌较差生存相关，但目前评估仍仅基于阳性核百分比，不考虑染色模式。染色强度从弱到强不等，反映细胞周期生理性波动，但强度无独立预后价值，任何强度的核阳性均应计数。Ki-67表达存在肿瘤间及肿瘤内异质性，低增殖的特殊类型癌（如小管癌、筛状癌、经典小叶癌）与无特殊类型浸润癌（NST）差异显著，后者不同区域增殖水平波动较大。Ki-67异质性指数（热点与全局水平的差值）与侵袭性特征及不良预后相关，提示评分时需涵盖反映染色异质性的视野，避免低估异质性肿瘤的增殖潜能。
预后意义
Ki-67长期被视为乳腺癌的重要预后标志物，高表达与高组织学分级、侵袭性生物学特征及不良预后相关。一项纳入46项研究共12155例患者的荟萃分析显示，Ki-67阳性率升高与全人群及淋巴结阳性、阴性亚组的复发风险升高及生存恶化显著相关。英国NHS体系20余家中心的8212例早期HR+HER2-乳腺癌多中心研究证实，免疫组织化学检测的Ki-67对死亡风险具有预后价值，尤其当肿瘤细胞表达≥30%时，校正临床病理参数后仍保持显著性。Ki-67（截断值10%）是PREDICT在线乳腺癌工具的核心变量之一，用于计算辅助内分泌及化疗的生存获益，指导辅助治疗决策。针对HR+乳腺癌新辅助内分泌治疗（NAET）的系统综述显示，Ki-67是术后生存的有力预测因子，即使短期内分泌治疗后Ki-67仍高者预后较差。此外，基线及新辅助化疗（NACT）2周期后的Ki-67变化率可预测治疗反应，基线Ki-67＞40%者更易获得病理完全缓解（pCR），且与无事件生存改善相关，这一价值在HER2阳性及三阴性乳腺癌（TNBC）中尤为突出。Ki-67还是术前内分泌预后指数（PEPI评分）的组成部分，PEPI评分为0的I期患者可豁免辅助化疗。
预测意义
在NAET场景中，基线及治疗14天后的Ki-67水平可预测无复发生存：POETIC试验长期随访显示，基线Ki-67低或经14天来曲唑诱导后Ki-67降至低水平的患者，单纯辅助内分泌治疗即可获得良好预后，而持续高Ki-67者可能需额外辅助治疗或新型药物临床试验。NACT通常可降低Ki-67增殖指数，多项研究显示基线Ki-67可预测pCR，尤其在HER2阳性及TNBC中，截断值32%或≥50%时预测效能显著，但这一结论尚未在所有队列中得到验证。
治疗意义
CDK4/6抑制剂
2021年美国FDA批准阿贝西利联合内分泌治疗用于HR+、HER2-、淋巴结阳性早期乳腺癌辅助治疗，MonarchE试验中Ki-67≥20%为入组标准之一，但该要求于2023年被取消。NATALEE试验证实瑞波西利联合来曲唑可改善高风险HR+、HER2-早期乳腺癌的无复发生存，FDA及英国国家卫生与临床优化研究所（NICE）相继批准该适应症，其中2级淋巴结阴性患者若Ki-67≥20%或基因组检测评分高则符合治疗指征，这使得准确、标准化的Ki-67染色与评分需求更为迫切。
辅助放疗降阶
PRIMETIME试验采用IHC4+C检测中的Ki-67评分联合临床因素，筛选极低危ER+HER2-1/2级乳腺癌患者以降阶或豁免辅助放疗，结果预计2027年公布。LUMINA试验则将Ki-67≤13.25%作为筛选标准，证实≥55岁、T1N0管腔型乳腺癌保乳术后内分泌治疗患者，若Ki-67≤13.25%则复发风险极低，可安全豁免放疗，该研究中三家中心实验室通过严格的染色质控确定了上述截断值。
当前国际指南中Ki-67的应用
圣加仑共识2021年推荐以≥20%作为管腔A型乳腺癌高表达截断值，替代2011年的14%阈值，2025年最新共识建议Ki-67联合肿瘤分级指导化疗决策，在无法获取多基因检测时作为首选参考，同时采纳国际Ki-67工作组（IKWG）推荐：Ki-67≥30%推荐化疗，≤5%不推荐化疗，多数早期ER+乳腺癌处于中间区间。2024年欧洲肿瘤内科学会（ESMO）早期乳腺癌病理评估指南首次纳入Ki-67检测。美国临床肿瘤学会（ASCO）2022年推荐在无多基因检测时，Ki-67联合其他临床病理参数指导绝经后患者辅助化疗及内分泌治疗决策，强调其预后价值主要体现在＜5%及＞30%区间，且不支持用于绝经前患者；同时推荐以≥20%作为淋巴结阳性高风险患者接受阿贝西利联合内分泌治疗的参考阈值。值得注意的是，英国皇家病理学院（RCPath）/英国国家健康服务体系乳腺筛查项目（NHS BSP）指南未常规推荐Ki-67检测，美国癌症联合委员会（AJCC）2019及2025年第9版指南均因实验室间可重复性差未将其纳入常规评估，美国病理学家协会（CAP）及美国国家综合癌症网络（NCCN）指南也未将其列为常规检查项目。部分国家制定了特异性指南：加拿大病理学家协会推荐根据肿瘤科医师申请个案检测；瑞典指南推荐2级、T1c/T2病变且Ki-67全局评分中间者行分子检测；德国指南（含2026年更新版）推荐穿刺活检诊断乳腺癌时常规检测Ki-67，与ER、PR、HER2并列。
Ki-67免疫组织化学的技术考量与局限性
分析前因素
样本选择方面，穿刺活检因固定效果好为首选，充分固定的手术标本也可使用，但研究显示同一肿瘤穿刺与手术标本Ki-67中位数差异可达5.3%，主要归因于固定差异。固定环节需严格控制冷缺血时间＜1小时，切片后充分浸入10%中性缓冲福尔马林，固定延迟16小时或过度延长固定时间均可导致Ki-67染色强度及百分比下降，弱阳性核转为阴性，造成增殖指数低估。
分析因素
需使用新鲜切片的4μm厚FFPE切片按试剂盒流程染色，首选MIB-1抗体，且需匹配兼容染色平台：MIB-1与Dako Agilent平台适配性最佳，MM1克隆与Leica Biosystems平台联用可获得优质染色。苏木素复染强度至关重要：过深会掩盖弱Ki-67表达，过浅则难以识别阴性核。需设置包含不同表达水平的内对照，目前MKI-67敲除HeLa及MCF7细胞系已可作为商业化对照来源，NordiQC室间质评已验证其标准化价值。强烈推荐参与UK NEQAS ICC & ISH或NordiQC的Ki-67专项室间质评计划。
分析后因素
评分方法包括全局评估法、热点评估法及估算法等。全局评估法由IKWG推荐，首先评估肿瘤内高、中、低及极低增殖区的占比，按算法确定最多4个待评估高倍视野，每个视野采用“打字机式”计数最多100个浸润性肿瘤细胞核，该方法可提升观察者间一致性，但耗时较长。加权全局法额外考虑不同染色强度区域的占比，可通过专用移动端应用计算，但仍未解决耗时问题。估算法（“目测法”）操作便捷，但在中间表达区间的观察者内及观察者间变异性极高，不推荐单独用于5%–30%区间的评分。热点评估法需识别增殖最活跃区域并计数500个细胞核，但病理医师对热点区域的判定一致性差，目前未获推荐。
Ki-67截断值
文献中针对不同适应症及亚型提出了多种截断值，如PEPI评分采用2.7%、7.3%、19.7%、53.1%分层；圣加仑2011年推荐14%，2021年更新为20%；LUMINA试验采用13.25%筛选放疗豁免人群；NICE 2025年瑞波西利适应症推荐≥20%。但多数截断值来自单队列事后分析，缺乏跨人群可重复性，固定截断值易导致分类误差。连续变量建模虽更符合增殖活性与风险的线性关系，但不利于临床二元决策，因此推荐采用三级分类：＜5%为低增殖，＞30%为高增殖，5%–30%为中间区间。中间区间因评分变异性大尚未获临床验证，推荐此类病例采用IKWG全局评估法计数或由两名专业人员双盲评分，数字图像分析（DIA）/AI算法为优选方案。病理科与多学科团队（尤其是肿瘤科）的密切沟通至关重要，需明确检测适应症、结果解读及临床意义。
数字病理学与AI
数字病理学已在英国等地区获批用于乳腺筛查诊断，为AI算法应用于形态学及生物标志物评分奠定了基础。AI可提升Ki-67等标志物评分的准确性与可重复性，并缩短检测时间。多中心研究显示，90名病理医师采用AI评分后，增殖指数（PI）误差显著降低（p＜0.001），观察者间一致性提升，中位周转时间缩短11.9%；AI评分的预后效能及对管腔B型的识别灵敏度均优于人工评分，且与手工热点及全局评估结果一致性良好。AI自动识别热点的评分高于人工判定热点，且不同数字平台间热点评估的一致性优异。经充分验证的AI算法可显著减少Ki-67评估耗时，提升评分一致性，助力应对临床检测需求增长，但需强调AI为辅助工具，必须由病理医师监督。目前已有研究探索基于Ki-67空间分布的人工智能预后模型，其分层效能优于传统Ki-67指数，仍需进一步验证。
AI实施的实践要点
仅限使用经充分验证、获CE-IVDR认证的算法，研究用途算法不得用于临床路径。ESMO发布的肿瘤AI生物标志物（EBAI）指南要求，Ki-67等AI定量工具属于EBAI A类，需完成一致性研究（分析验证），由至少两名盲法专家与AI结果比对。正式上线前需完成内部验证，推荐纳入至少50例涵盖低、中、高表达的样本，评估与“金标准”的一致性并分析差异原因，重点关注临床相关截断值（如CDK4/6抑制剂适应症的20%）附近的差异。
多基因检测中的MKI-67及其与Ki-67免疫组织化学的关系
MKI-67是Oncotype Dx、Prosigna、EndoPredict及MammaTyper等多基因检测的组成部分，但未被纳入MammaPrint。研究显示Ki-67免疫组织化学与多基因检测结果一致性有限：低（＜15%）及高（＞30%）Ki-67区间与MammaPrint风险预测一致性较高，中间区间MammaPrint可提供额外信息；Oncotype Dx复发评分（RS）与Ki-67免疫组织化学仅呈中等一致性，低RS但高Ki-67者3年复发率及内分泌耐药率显著升高；OptimaPrelim试验显示Ki-67与Oncotype Dx、Prosigna、MammaPrint的一致性仅在≥30%截断值时较高。总体而言，Ki-67免疫组织化学与多基因检测mRNA结果不可互换，ASCO基于MonarchE及NATALEE试验标准，仍将Ki-67＞20%作为CDK4/6抑制剂的联合筛选指标之一。
中低收入国家（LMIC）中Ki-67作为多基因检测的替代方案
由于多基因检测可及性受限，多项研究支持在LMIC中将Ki-67联合临床病理参数作为替代方案：IHC3模型（Ki-67、PR、肿瘤大小、分级）可模拟21基因签名预测复发风险，Ki-67联合分级、大小、PR等指标可作为多基因检测的 surrogate 标志物。ASCO及圣加仑共识均允许在无多基因检测条件时，采用Ki-67联合临床病理参数指导治疗决策。
总结与推荐
Ki-67对ER+HER2-乳腺癌具有明确预后价值，在辅助CDK4/6抑制剂等高风险早期乳腺癌治疗选择中发挥关键作用。推荐基于临床申请个案开展Ki-67评估，而非对所有浸润性乳腺癌进行反射检测。决策CDK4/6抑制剂使用时首选MIB-1抗体及匹配染色平台，严格控制分析前（尤其是固定）及分析环节质量，参与相关技术与判读室间质评。仅核染色（含弱阳性）计入评分，由受训病理医师完成评分，疑难病例推荐双人双盲评分。目测法仅适用于＜5%及＞30%的极端表达区间，5%–30%中间区间需采用IKWG全局评估法或双人评分。推荐以连续变量报告Ki-67评分，同时标注适应症相关截断值，病理科与肿瘤科需就检测适应症及截断值达成统一共识。经验证的AI软件作为辅助工具可提升结果准确性与时效性。
