通过自动化磁珠辅助提取，再利用4-(氨基甲基)-N,N-二甲基苯胺-d0/d6进行化学同位素衍生化处理，最终通过LC-MS/MS技术测定源自n-6和n-3多不饱和脂肪酸的氧化脂质
《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Automated magnetic-bead-assisted extraction followed by chemical isotope derivatization with 4-(aminomethyl)-N,N-dimethylaniline-d0/d6 for determination of oxylipins derived from n-6 and n-3 polyunsaturated fatty acids by LC-MS/MS
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•研究人员开发出一种高灵敏度的同位素衍生化方法（灵敏度约为常规方法的1500倍），用于定量检测69种氧化脂质。•首次将自动磁珠辅助提取技术应用于氧化脂质的分析中。•建立了保留指数预测模型，有助于筛选和鉴定未知的区域异构体。引言n-6和n-3系列的多不饱和脂肪酸是膜磷脂的重要组成部
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研究人员开发出一种高灵敏度的同位素衍生化方法（灵敏度约为常规方法的1500倍），用于定量检测69种氧化脂质。
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首次将自动磁珠辅助提取技术应用于氧化脂质的分析中。
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建立了保留指数预测模型，有助于筛选和鉴定未知的区域异构体。
引言
n-6和n-3系列的多不饱和脂肪酸是膜磷脂的重要组成部分，它们通过调节膜的特性来影响细胞功能。此外，多不饱和脂肪酸还是多种生物活性脂质介质的前体，这些脂质介质与多种生理和病理过程密切相关[1]。通过脂氧酶、环氧化酶或细胞色素P450等酶促氧化反应，或是非酶促途径，多不饱和脂肪酸会被氧化形成氧化脂质。这些化合物在炎症、免疫反应以及其他细胞过程中发挥着重要的信号传导作用[2]。
由关键多不饱和脂肪酸衍生的氧化脂质，尤其是亚油酸（AA；20:4 n-6）、亚麻酸（LA；18:2 n-6）、α-亚麻酸（ALA；18:3 n-3）、二十碳五烯酸（EPA；20:5 n-3）以及二十二碳六烯酸（DHA；22:6 n-3），一直备受研究关注。它们在多种疾病中发挥着重要作用，包括炎症性疾病、胰岛素抵抗、心血管疾病以及神经系统疾病[3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10]。尽管结构相似，不同氧化脂质却具有截然不同的生物活性。例如，由亚油酸衍生的前列腺素具有强烈的促炎作用，而由DHA衍生的溶素则具有显著的抗炎和促进炎症消退的作用[11]。这种功能多样性凸显出对氧化脂质进行全面分析的必要性，以便明确它们在健康和疾病状态中的作用。
然而，由于氧化脂质在生物体内的含量较低、结构高度相似，且在电喷雾质谱分析中的电喷雾离子化效率较差，因此同时定量检测多种氧化脂质仍然是一项艰巨的分析挑战。为克服这些难题，人们开发了多种以羧基为靶点的衍生化策略，常用的试剂包括2,4-双（二乙氨基）-6-肼基-1,3,5-三嗪[12]、胆碱[13]、5-(二异丙基氨基)戊胺[14]以及2-二甲基氨基乙胺[15], [16]。这类方法通过引入具有高离子化效率的基团，提升了质谱分析的灵敏度，同时也有助于改善色谱分离效果。此外，化学同位素标记技术可通过使用与目标分子同位素匹配的内标，实现精准定量，从而显著降低分析过程中的变异系数，并减少内标的使用成本。
尽管取得了这些进展，氧化脂质分析的样品前处理流程仍然存在瓶颈。传统方法主要依赖固相萃取技术，相比蛋白质沉淀法和液液萃取法，固相萃取已被证明是一种更为可靠的手段，能够从复杂样本基质中选择性地分离和富集多种氧化脂质[17], [18], [19]。不过，固相萃取技术在临床应用中仍面临诸多实际和方法上的限制。从操作层面来看，该技术耗时费力、通量低，且需要大量溶剂。从方法学角度来看，其结果易受操作人员的影响，难以保证高通量临床检测中的重复性。为解决这些问题，人们开始将磁固相萃取技术应用于临床生物标志物的分析，比如儿茶酚胺[20]和类固醇[21], [22]。
在本研究中，我们开发了一种集成化的自动样品前处理策略，结合了磁固相萃取技术与基于4-AND-d0/d6的化学同位素衍生化方法。这一创新方法有效解决了样品前处理复杂、检测灵敏度不足以及分析通量低等问题。此外，我们还建立了基于保留指数的预测模型，该模型能够将羟基、二羟基、酮基、环氧基以及过氧化氢基团等关键官能团的存在及其位置与色谱行为联系起来，从而帮助鉴定那些此前未被表征的氧化脂质。作为概念验证，我们将该方法应用于新生鼠缺氧缺血性脑病模型血清样本中的氧化脂质分析，以此评估该方法在复杂生物基质中的应用潜力。与传统方法相比，这一集成化平台具有更高的灵敏度、更好的重复性以及更高的分析通量，为生物医学研究中的脂质介质分析提供了有力的工具。
章节要点
化学品与试剂
氧化脂质标准品购自美国密歇根州安娜堡的Cayman Chemical Company公司。4-AND-d6则由中国上海的Adamas Reagent Co.公司提供。HATU、三乙胺、4-AND-d0、乙腈（质量分析级）、甲醇（质量分析级）以及氯仿均由美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich公司提供。超纯水则通过美国马萨诸塞州贝德福德的Millipore公司的水净化系统制备而成。
工作流程说明
我们采用了一种集成化的液相色谱-质谱/质谱分析策略，用于全面定量检测生物样本中的氧化脂质（见图1）。整个分析流程首先是通过自动磁珠辅助提取技术获取氧化脂质，随后进行同位素标记衍生化处理。在此步骤中，生物样本中内源性氧化脂质的羧基会与衍生化试剂4-AND-d0的氨基发生反应。与此同时，相应的混合氧化脂质标准品则会与氘代试剂4-AND-d6发生反应，以此作为后续分析的参照标准。
结论
在本研究中，我们开发了一种集成化的液相色谱-质谱/质谱分析策略，该策略结合了自动磁珠辅助提取技术与化学同位素标记衍生化方法，可用于全面定量检测生物样本中的氧化脂质。自动磁珠辅助提取技术简化了样品前处理流程，提高了该方法与高通量分析流程的兼容性；而基于4-AND-d0/d6的化学同位素衍生化技术则提升了质谱分析的灵敏度，同时也有助于改善氧化脂质在色谱柱中的分离效果。
CRediT作者贡献说明
陈俊赫：论文撰写——初稿撰写、方法验证、方法设计。周宏伟：论文撰写——审阅与编辑、研究指导、概念构思。王倩：论文撰写——审阅与编辑、概念构思。夏芳波：论文撰写——审阅与编辑、初稿撰写、资金筹集、概念构思。吴帆：方法设计、数据整理。聂成涛：方法验证、数据整理。崔鹏：论文撰写——初稿撰写、正式数据分析、数据整理。
利益冲突声明
所有作者均声明，他们不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
陈俊赫|崔鹏|聂成涛|吴帆|王倩|周宏伟|夏芳波
