《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Decoding thermal instability in peptide therapeutics links microheterogeneity to bioactivity loss
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•cIM-MS能够高精度地分辨肽的拓扑异构体。•Stlassin具有稳定的构象，而balixafortide则存在构象多样性。•热应力会引发肽的降解与构象重排。引言近年来，生物技术和生物工程领域的突破极大拓展了创新疗法的分子结构与作用机制[1]。尤其是肽类药物，因其独特的结构和药
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cIM-MS能够高精度地分辨肽的拓扑异构体。
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Stlassin具有稳定的构象，而balixafortide则存在构象多样性。
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热应力会引发肽的降解与构象重排。
引言
近年来，生物技术和生物工程领域的突破极大拓展了创新疗法的分子结构与作用机制[1]。尤其是肽类药物，因其独特的结构和药理特性，已成为当代药物研发和临床应用中的重要角色[2]、[3]。肽类通常由几到几十个氨基酸残基组成，其分子量介于通过化学合成得到的传统小分子药物与较大的蛋白类生物制剂之间[4]。与蛋白质类似，肽类的生物活性取决于其一级序列及更高阶的构象，同时它们相对较小的尺寸便于进行精确的化学合成、序列设计及生产控制[3]、[4]。这种介于两种主要药物类型之间的特性，使得基于肽的中等分子量疗法在肿瘤学、代谢性疾病、免疫调节以及罕见病等领域具有广阔的应用前景。例如，靶向肽类放射性药物和GLP-1受体激动剂肽，正是近年来在精准治疗和代谢疾病管理领域进展迅速的关键方向[5]、[6]。
然而，由于肽类的大小处于中间范畴，目前用于检测小分子或蛋白质的质量控制方法无法全面评估其关键质量属性[7]、[8]、[9]。肽类对制造、运输和储存过程中遇到的各种环境应力极为敏感，温度变化、氧化条件或机械力都可能引起其构象或局部结构的细微变化[10]。这些变化往往不会导致分子量明显改变或明显的化学降解，因此很难通过常规的物理化学方法检测出来，但却会显著影响其生物活性和体内安全性[8]。因此，制定能够可靠检测结构完整性和构象准确性的质量控制策略，对于确保肽类疗法的安全性与有效性而言至关重要[11]。
随着分析技术的不断进步，肽类药物的质量控制需从传统的物理化学纯度检测转向对空间构象的精准表征[12]。与大型蛋白质不同，肽类的关键质量属性主要包括一级结构完整性、与序列相关的化学变异、二硫键或其他共价连接、生物活性以及稳定性[13]。反相高效液相色谱（RP-HPLC）或电泳等传统方法虽可检测样品纯度，但像侧链氧化、脯氨酸顺反异构化、残基消旋或轻微的二硫键重组之类的细微变化，往往不会改变保留时间或分子量，却会显著影响受体结合能力及药代动力学特性[13]、[14]、[15]。因此，仅依靠分子量、总含量及简单的电荷差异等指标，不足以全面评估肽类的质量与稳定性。鉴于微观结构特征对肽类活性和安全性具有重要影响，现代质量控制体系亟需采用对构象敏感的正交表征方法来深入分析这些结构层面的质量属性[16]。
为满足这些需求，从质量控制的角度来看，迫切需要能够直接检测接近天然条件下分子空间构象差异的分析技术。近期，离子迁移谱-质谱联用技术（IMS-MS）作为一种对结构敏感的分析工具，在这一领域逐渐凸显出重要性[17]、[18]。该技术利用电场和缓冲气共同作用下的离子迁移行为差异，能够在毫秒级时间内实现分子空间构象的快速分离，同时获取质荷比数据及与构象相关的参数[19]。与传统色谱法相比，IMS-MS能更直接地反映分子的空间位阻差异，因此在肽类及其他复杂中等分子量药物的构象分析中具有独特优势[20]。在IMS-MS技术体系中，循环离子迁移谱通过构建环形离子传输路径，使分析物离子在迁移区域内进行单圈或多圈的迁移分离，从而进一步提升构象分辨率[20]、[21]。相较于传统的线性离子迁移装置，这种方法在保持仪器体积较小的同时，仍能精确区分不同的构象状态和拓扑异构体，为基于肽的中等分子量药物的构象质量控制提供了新的技术途径。
在各类肽类药物中，Stlassin和Balixafortide是具有受限大环骨架的功能性肽类代表（见图1）[22]、[23]。Stlassin属于套索肽一类，归属于核糖体合成并经过翻译后修饰的肽类（RiPPs）家族[22]。它的典型结构特征是由N端氨基与侧链羧基通过异肽键形成一个大环，C端肽链则穿过该环，并被较大的“填充”残基固定，从而形成稳定的套索状结构[22]。这种独特的三维折叠结构使其具有极强的耐热性、耐化学性和抗蛋白酶水解性，使得Stlassin在结构稳定性和构象保持方面优于线性肽类。正是这些特性，使得这类药物成为研究肽类构象稳定性、拓扑异构现象以及构象相关质量属性的理想模型分子。另一方面，Balixafortide（POL6326）是一种合成的环状肽类CXCR4受体拮抗剂，最初作为造血干细胞/前体细胞动员剂被开发，后来在肿瘤学研究中也受到了关注[23]、[24]。它通过干扰CXCL12-CXCR4信号通路，调节细胞的迁移和滞留行为，进而影响肿瘤微环境，并提高多种模型中肿瘤细胞对治疗的敏感性。与小分子CXCR4拮抗剂不同，Balixafortide依赖精确定义的氨基酸序列及特定的三维构象才能有效识别CXCR4受体，因此哪怕是微小的构象变化都可能影响其生物活性[24]。由于其靶点明确、空间结构复杂且已进入临床研究阶段，Balixafortide也是研究中等分子量肽类构象稳定性及质量控制问题的理想模型。
因此，本研究选取具有不同结构特征和生物学功能的Stlassin与Balixafortide作为代表性肽类药物。通过加速稳定性实验，我们研究了它们在热应力作用下的构象演变，并运用循环IMS-MS技术对其进行了高精度的拓扑结构分析[20]。以Stlassin为模型，我们首先证明了具有明确三维结构的肽类在离子迁移谱质谱分析中能够保持稳定的单一构象状态，从而验证了循环离子迁移谱质谱技术能够准确识别处于单一构象空间的肽类。随后，我们又观测到了变性过程中的细微构象变化，进一步证实了肽类构象与其生物活性之间的密切关联，这一结论在Balixafortide研究中也得到了体现。本研究旨在建立一套分析策略，用于评估结构复杂的肽类疗法的构象异质性、结构完整性及降解行为。
章节摘录
材料
Balixafortide（5毫克/瓶）购自美国新泽西州蒙茅斯琼斯的MedChemExpress LLC公司。Stlassin（3.4毫克/瓶）由中国北京大学的马明教授提供。在哺乳动物表达系统中制备、并带有N端人IgG1 Fc标签的重构人C-X-C趋化因子受体4（CXCR4）则购自中国苏州的Novoprotein公司。色谱级乙腈则由美国密歇根州穆斯基根的Honeywell International Inc.公司提供，此外
HPLC对热诱导构象异质性的分辨率有限
最初，人们使用HPLC来评估Stlassin和Balixafortide的热稳定性和降解行为。在不同温度条件下培养样品后，将其转移至HPLC色谱管中，按照预定的梯度程序进行分析（见图2）。如图所示，Stlassin的主峰出现时间约为14.5分钟，在三种温度条件下其保留时间均未出现明显变化。而在80℃条件下处理后，Stlassin出现了
结论
在本研究中，我们以具有明确绝对立体化学构型的套索肽Stlassin为研究对象，证明了cIM-MS是一种高效的构象分析平台，能够分辨具有明确三维结构的肽类疗法的拓扑异构体[22]。而对另一种正在研究的抗癌肽类Balixafortide的进一步分析表明，传统的液相色谱方法难以充分描述其构象变化或
CRediT作者贡献说明
葛一峰：撰写——审稿与编辑、方法学、实验研究、正式分析。 朱绍洲：撰写——初稿撰写、方法学、实验研究、正式分析、概念构思。 徐明哲：撰写——审稿与编辑、监督指导、方法学、资金筹集、概念构思。 黄海伟：撰写——审稿与编辑、监督指导、概念构思。
关于写作过程中生成式AI及AI辅助技术的声明
在撰写本文时，作者们使用了ChatGPT工具来检查语法并进行语言润色。在使用该工具后，作者们对内容进行了必要的审核和修改，并对最终发表文章的内容承担全部责任。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
衷心感谢北京市自然科学基金（编号7202107）、国家自然科学基金委员会（NSFC；项目编号21706005和32260229）、国家药品监督管理局化学药品质量研究与评价重点实验室学科建设基金（编号2025HYZX19）以及国家药品监管科学重点实验室提供的资金支持。
朱绍洲|葛一峰|黄海伟|徐明哲
