一种用于筛选肿瘤细胞及诊断非小细胞肺癌的硫化氢激活型荧光探针

《Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology》：A hydrogen sulfide activated fluorescence probe for screening tumor cells and diagnosis of non-small cell lung carcinoma

　　

摘要

荧光探针被用作诊断和治疗癌症的化学工具。尽管某些荧光探针已成功开发，但在敏感诊断和有效治疗方面仍存在巨大需求。在本研究中，我们开发了一种新型的H₂S激活型荧光探针CerYT，该探针以硝基苯并噁二唑作为成像荧光团，以塞瑞替尼作为针对肿瘤细胞的强效ALK激酶抑制剂。该探针具有较高的灵敏度（LOD = 121 nM）和特异性，还能在细胞和肿瘤中精准检测H₂S。此外，CerYT探针在肿瘤细胞中能产生更强的荧光，从而实现肿瘤细胞的敏感诊断，同时释放出的塞瑞替尼可对肿瘤细胞造成严重损伤。因此，塞瑞替尼与H₂S激活的协同作用为肿瘤细胞和癌病的诊断与治疗提供了高效手段。

引言

癌症已成为全球范围内威胁人类健康的主要疾病，这促使人们致力于开发新的技术以实现精准的癌症诊断[1]、[2]、[3]。荧光成像技术是一种可靠的癌症成像工具，具有出色的选择性、高灵敏度、操作简单、快速无创分析以及原位可视化监测能力[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]。然而，在癌症检测的荧光成像中，难以准确定位癌细胞区域，且正常组织与恶性组织之间的对比度较低，这些都是亟待解决的难题。因此，人们迫切需要具备更好定位能力和更高对比度的成像技术。

硫化氢（H₂S）是一种有害的环境污染物，来源于石油、采矿、造纸和水处理行业[20]、[21]、[22]、[23]。虽然低浓度（<5 ppm）的H₂S并无危害，但高浓度的该气体会对人类生命健康构成严重威胁，可能导致嗅觉丧失、瘫痪、失去意识，甚至死亡。此外，H₂S广泛存在于肉类、鱼类和鸡蛋等富含蛋白质的食物中，它是食物中的蛋白质被细菌分解时产生的主要挥发性化合物[24]、[25]、[26]。因此，有必要在环境和食品样本中实时检测H₂S。另外，H₂S还被认为是第三种内源性生物信号分子，参与海马体长时程增强效应的调节、氧化应激的减轻、神经元功能的控制以及胰岛素的调节[9]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]。在哺乳动物细胞中，H₂S主要来自半胱氨酸、同型半胱氨酸和半胱硫氨酸，通过半胱硫氨酸β-合成酶、半胱硫氨酸γ-裂解酶和3-巯基丙酮酸硫转移酶等酶的作用生成。H₂S已被视为多种疾病的生物标志物，其功能紊乱可能与高血压、糖尿病、心血管疾病、肝硬化、唐氏综合征、阿尔茨海默病等疾病的发病机制有关。在活体系统中实时、原位检测H₂S对于阐明内源性H₂S在疾病发生中的作用具有重要意义，也有助于相关疾病的诊断[32]、[33]、[34]、[35]。

化疗被认为是最有效的癌症治疗手段之一，它通过化学药物对肿瘤细胞造成伤害，已成为肿瘤治疗中的常用方法[36]、[37]、[38]。然而，由于化学药物的选择性不足，其在抑制或破坏癌细胞的同时，也会对体内快速增殖的正常细胞造成严重毒性，从而导致明显的毒副作用，严重影响患者的健康状况。因此，如何将化疗药物精准地释放到肿瘤细胞内部，已成为一个亟需解决的生物学问题。以往用于检测H₂S的分析方法，如电化学技术、硫化物沉淀法、原子吸收光谱法和色谱法，通常需要昂贵的设备，操作流程复杂，且需要专业人员操作，因此不适用于体内H₂S的检测。而荧光探针方法则具有操作简单、响应时间短、时间和空间分辨率高、无创检测以及可实时可视化等优点，已被广泛用于检测和定量水生环境及生理系统中的H₂S[13]、[39]、[40]、[41]、[42]、[43]、[44]、[45]、[46]、[47]、[48]。迄今为止，人们已经利用多种反应方法开发出了多种H₂S选择性荧光探针，如H₂S介导的叠氮化物还原、硝基或羟基酰胺还原，以及对醚类、酯类和双键的亲核攻击反应。但这些探针仍存在一些缺陷，如激发/发射波长有限、斯托克斯位移小、易受生物硫醇干扰、灵敏度低以及响应时间长（通常为20分钟至2小时），这些都会妨碍对生物过程中H₂S的实时监测和成像。为克服这些限制，人们多年来一直在不断研究新型且高效的H₂S荧光探针。

本研究介绍了一种小分子荧光探针CerYT，该探针可用于抑制肿瘤，并灵敏检测肿瘤组织内的H₂S水平。在研究中，我们选用NBD染料作为主要荧光团，同时使用塞瑞替尼这种经典的间变性淋巴瘤激酶抑制剂，以提高对癌症的靶向性和治疗效果。我们利用NBD与哌啶基团的连接键——这一结构通常作为H₂S的作用位点——来减弱荧光团的荧光强度。含有药物的探针在细胞和组织环境中均表现出对H₂S的高选择性和良好的靶向能力。所有实验结果都表明，利用CerYT可以轻松实现对癌变组织的精准识别和治疗。

章节节选

概述

所有化学品均从中国上海的Energy Chemical公司购买，无需进一步纯化即可使用。超纯水则通过Millipore Milli-Q水过滤装置制备。相关实验设置、方法、表征数据及所用仪器的详细信息详见补充材料。

CerYT探针的合成

5-氯-N2-(2-异丙氧基-5-甲基-4-(1-(7-硝基苯并[c][1,2,5]噁二唑-4-基)哌啶-4-基)苯基)-N4-(2-(异丙基磺酰基)苯基)嘧啶-2,4-二胺。

CerYT探针的光谱响应

为了实现对H₂S的定量检测，我们使用了CerYT探针进行了荧光滴定实验。如图2a所示，该探针最初在551纳米处呈现黄色荧光；但随着H₂S逐渐加入探针溶液，荧光强度显著下降。当H₂S浓度达到500微摩尔时，荧光强度降至最低，之后不再发生变化。在442纳米处，加入H₂S后

结论

总之，我们成功开发并合成了一种新型的H₂S激活型荧光探针CerYT，该探针结合了ALK激酶抑制剂，可用于精准成像肿瘤细胞、癌组织，同时还能抑制非小细胞肺癌的发展。该探针具有优异的光谱性能，能够检测细胞中的H₂S，因此在生物成像领域具有重要的应用价值。此外，细胞筛选实验的结果表明，CerYT探针能够区分肿瘤细胞

CRediT作者贡献说明

Si Weijie：正式分析、数据整理。Guo Zhishan：正式分析。Zhang Yuzhe：正式分析。Meng Dan：软件支持、资源提供。Liu Shuxiang：正式分析。Zhang Zhenxing：初稿撰写、指导监督。Ma Junyan：修改润色、指导监督。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了以下机构的财政支持：中国国家自然科学基金（编号：22407004）；河南省自然科学基金（编号：242300421613）；河南省教育厅重点科技研究项目（编号：23A150040、23A210024）；安阳市科学技术计划项目（编号：2023C01SF210）；河南省重点研发推广专项（编号：232102310402）。同时，我们也感谢河南光电功能国际联合实验室的支持。

Weijie Si|Zhishan Guo|Yuzhe Zhang|Dan Meng|Shuxiang Liu|Zhenxing Zhang|Junyan Ma

中国河南省安阳市安阳师范学院河南省新型光电子功能材料重点实验室，安阳455000