挥发性驱动的柚皮精油抗氧化活性：衔接化学成分与细胞氧化还原调控

《Biochemistry Research International》：Volatile-Driven Antioxidant Activity of Pomelo Peel Essential Oil: Bridging Chemical Composition and Cellular Redox Modulation

　　

柚（Citrus maxima）皮精油是一种富含挥发性萜烯类化合物的植物提取物，可能在生物系统中表现出抗氧化相关效应。然而，其化学成分、常规抗氧化能力与氧化应激下的细胞效应之间的关系仍不明确。研究人员整合了气相色谱-质谱（GC-MS）成分分析、化学抗氧化测定以及基于SH-SY5Y细胞的氧化应激模型。在选定的分析和数据处理条件下，柠檬烯（limonene）是GC-MS唯一自信鉴定并积分的化合物。在化学测定中，与水溶性参比抗氧化剂Trolox和抗坏血酸（ascorbic acid）相比，柚皮精油表现出中等的DPPH自由基清除活性和铁还原能力。细胞效应分别在暴露于H2O2诱导氧化应激的SH-SY5Y细胞中评估。柚皮精油在共处理（cotreatment）和预处理（pretreatment）方案中测试了25、50和100 μg/mL三个浓度。在共处理模型中，细胞同时暴露于精油和H2O2；而在预处理模型中，细胞在H2O2挑战前先用精油孵育。柚皮精油减轻了细胞内活性氧（ROS）积累和脂质过氧化，并提高了细胞活力，在50和100 μg/mL时效果更明显。预处理通常产生比共处理更强的细胞保护作用。这些发现表明，仅凭常规化学抗氧化测定可能无法完全预测细胞抗氧化相关效应，特别是对于亲脂性精油。因此，柚皮精油在SH-SY5Y氧化应激模型中显示出细胞保护活性，尽管其贡献成分和潜在分子机制需要进一步研究。

研究背景方面，柚（Citrus maxima）在热带和亚热带地区广泛种植，其果皮生物质是重要的农业工业废弃物来源。柑橘副产品中富含生物活性化合物，特别是富含挥发性萜烯类的精油，其价值化利用日益受到关注。氧化应激是细胞损伤和神经退行性过程的关键机制，当活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）如超氧阴离子（O₂•^?）、过氧化氢（H₂O₂）和羟基自由基（•OH）超过内源性抗氧化防御能力时会发生氧化应激，导致脂质、蛋白质和核酸氧化，损害细胞功能与活力，其中脂质过氧化尤为关键，因为神经元膜富含多不饱和脂肪酸且极易受氧化损伤。常规化学抗氧化测定如DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）和FRAP（铁离子还原抗氧化能力）在简化反应条件下提供自由基清除或还原能力的估算，但可能无法完全预测复杂生物或富脂系统中的抗氧化相关效应，尤其是精油和单萜等疏水性化合物，因其倾向于分配至富脂环境，故需互补的细胞测定来评估氧化应激下的潜在效应。神经元系统中因高耗氧、多不饱和脂质丰富及再生能力有限，氧化应激相关性更高，人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞是研究神经元氧化损伤与细胞保护的成熟体外模型，H₂O₂暴露可诱导细胞内ROS生成、脂质过氧化和细胞死亡，模拟氧化应激相关神经元损伤特征。因此，研究人员旨在表征柚皮精油成分、评估其化学抗氧化活性并探究其在H₂O₂诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激中的细胞抗氧化相关及细胞保护效应，重点关注ROS积累、脂质过氧化与细胞活力关系，以衔接精油成分分析与生物功能，阐明其在细胞氧化还原调控中的潜在作用。该研究发表于《Biochemistry Research International》。

为开展研究，研究人员主要采用的关键技术方法包括：样本为泰国巴真府Si Mahosot区采收的Prachinburi栽培种柚果实外果皮，经水蒸气蒸馏法提取精油；采用气相色谱-质谱联用（Gas Chromatography–Mass Spectrometry, GC-MS）分析挥发性成分；采用DPPH法和FRAP法测定化学抗氧化能力；采用人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系建立H₂O₂诱导氧化应激模型，设置共处理与预处理两种方案；采用MTT法测定细胞活力；采用羧基-H₂DCFDA荧光探针测定细胞内ROS水平；采用C11-BODIPY 581/591脂溶性荧光探针测定脂质过氧化水平；采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及Tukey事后检验进行统计分析。

研究结果部分如下。

3.1. 柚皮精油的挥发性成分。GC-MS分析显示保留时间6.765 min处为主峰，经Wiley 7n.1质谱库比对鉴定为dl-柠檬烯（dl-limonene），匹配度96%。在选定GC-MS条件和数据处理阈值下，dl-柠檬烯是唯一被自信鉴定并积分的化合物，其100.00%指处理后色谱报告中积分峰的相对面积，不应解释为精油仅含柠檬烯，高保留时间低强度信号未充分分辨或自信鉴定，故未赋值或用于成分解释。

3.2. 柚皮精油的DPPH自由基清除活性。精油表现出中等清除活性，IC₅₀为1.85 ± 0.07 mg/mL，TEAC（Trolox等效抗氧化容量）为112.4 ± 3.6 μmol TE/g样品。Trolox和抗坏血酸IC₅₀分别为0.021 ± 0.002 mg/mL和0.018 ± 0.001 mg/mL，纯柠檬烯IC₅₀为3.92 ± 0.15 mg/mL，表明其自由基清除能力有限。尽管仅鉴定出柠檬烯，但整体精油抗氧化行为不能仅由其解释，微量成分或组分互作贡献仍为假设。

3.3. 柚皮精油的FRAP。精油表现中等还原能力，为98.6 ± 4.2 μmol Fe²⁺/g样品，对应105.3 ± 3.8 μmol TE/g样品。抗坏血酸和Trolox的TE值分别为1125.4 ± 30.2和1000.0 ± 25.0 μmol TE/g，纯柠檬烯为28.4 ± 1.6 μmol Fe²⁺/g，电子供给能力有限。

3.4. 柚皮精油对SH-SY5Y细胞H₂O₂诱导细胞毒性的细胞保护效应。精油改善氧化应激下细胞活力。共处理模型中，100 μg/mL组细胞活力65.0 ± 2.5%，显著高于H₂O₂组50.0 ± 3.0%（p < 0.05）；预处理模型（6 h精油预孵育后H₂O₂ 24 h）活力达80.0 ± 2.8%，高于H₂O₂组和共处理组（p < 0.05），表明预处理细胞保护效应更强。溶剂对照和单纯精油对照无细胞毒性。

3.5. 细胞内ROS水平。H₂O₂暴露使ROS升至对照约175%（176.3 ± 9.7%），共处理100 μg/mL降至约135%（136.8 ± 7.2%，p < 0.05 vs H₂O₂组），预处理降至约120%（121.4 ± 6.1%，p < 0.05 vs H₂O₂组），但均高于对照。精油减轻H₂O₂诱导的细胞内ROS积累，预处理效应更大。

3.6. 柚皮精油对脂质过氧化的影响。H₂O₂使绿/红荧光比升至1.86 ± 0.12（对照1.00 ± 0.08，p < 0.05）。共处理25、50、100 μg/mL分别降至1.69 ± 0.11、1.52 ± 0.10、1.31 ± 0.09（p < 0.05 vs H₂O₂组）；预处理对应浓度为1.58 ± 0.10、1.29 ± 0.08、1.12 ± 0.07（p < 0.05），同浓度预处理比值低于共处理。精油以浓度依赖方式减轻H₂O₂诱导的SH-SY5Y细胞脂质过氧化。

讨论部分总结：GC-MS仅鉴定出柠檬烯为主成分，但不代表精油仅含柠檬烯，低强度信号未可靠分辨，微量成分或互作贡献仍属假设，未来需优化条件或用标准品鉴定定量。化学抗氧化测定中精油表现中等，因亲脂性化合物在均相体系溶解度受限，DPPH和FRAP可能无法完全预测生物或富脂环境效应。细胞实验中精油在SH-SY5Y模型中关联更明显的细胞抗氧化相关响应，伴随较低ROS荧光、较低C11-BODIPY氧化比及较高活力，但这些是氧化应激相关终点的汇聚变化，未确立特定抗氧化通路。预处理优于共处理可能暗示细胞对后续氧化挑战的修饰反应，但未直接检测适应性信号通路，与Nrf2/ARE轴等 redox-sensitive 通路的关系需未来研究。脂质过氧化降低与铁死亡（ferroptosis）相关脂质损伤减少一致，但未检测GPX4活性、铁水平等关键标记，关系仅为假设。研究表明化学测定单独可能无法完全预测细胞效应，需考虑亲脂性、膜分配等。局限包括仅鉴定柠檬烯、单一细胞模型、未直接检测分子机制、ROS荧光未归一化至蛋白等。

结论部分翻译：总之，在H₂O₂诱导的SH-SY5Y氧化应激模型中，柚皮精油与较高的细胞活力及较低的基于荧光的氧化应激读数相关，尤其在50和100 μg/mL时。这些响应伴随着较低的相对细胞内ROS荧光和降低的C11-BODIPY绿/红荧光比，且预处理方案比共处理表现出更有利的模式。25 μg/mL的响应较弱且依赖于终点，尤其在共处理条件下。本发现应解释为体外抗氧化相关细胞保护的证据，而非神经保护、膜特异性抗氧化作用、铁死亡抑制或确认分子通路激活的决定性证据。需要进一步研究以鉴定微量成分、比较整体精油与纯柠檬烯，并探究抗氧化酶调控、Nrf2相关信号、谷胱甘肽状态、GPX4活性、细胞内铁水平及铁死亡相关标记。