《Cladistics》：Clues of ancient incomplete lineage sorting during bivalve evolution undermine support for Heterodonta
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系统发育基因组学（phylogenomics）中一个长期存在的挑战，是解析源自古老辐射事件（ancient radiations）的类群关系。在这类情况下，不完全谱系分选（incomplete lineage sorting, ILS）等现象会增加对相互冲突拓
系统发育基因组学（phylogenomics）中一个长期存在的挑战，是解析源自古老辐射事件（ancient radiations）的类群关系。在这类情况下，不完全谱系分选（incomplete lineage sorting, ILS）等现象会增加对相互冲突拓扑解的支持。双壳纲（Bivalvia）的大部分多样性起源于奥陶纪（Ordovician）辐射；事实上，双壳纲内部若干深层关系至今尚未得到完全解析。传统上，异齿亚纲（Heterodonta）将古异齿亚纲（Archiheterodonta）与真异齿亚纲（Euheterodonta）聚为一支；然而，近期分析支持古异齿亚纲与另一亚纲古异齿类（Palaeoheterodonta）互为姐妹群（A?+?P）。迄今为止，古异齿亚纲一直是唯一缺乏基因组组装的主要双壳纲类群：研究人员对 leana心蛤（Cardita leana；古异齿亚纲，心蛤科 Carditidae）进行了基因组测序，并基于包含64个双壳纲物种的超级矩阵（supermatrix）推断系统发育关系。尽管不同方法支持异齿亚纲（Heterodonta），但大量基因——占数据集的27%——更支持古异齿亚纲 + 古异齿类（A?+?P）。这种不一致性不能归因于任何系统性系统发育偏倚（systematic phylogenetic biases）。然而，由各自支持基因数据集获得的分歧时间（divergence times）显示，异齿亚纲的起源显著早于A?+?P的起源，这一结果与化石记录（fossil record）不一致。该结果提示，支持异齿亚纲的基因反映了祖先多态性（ancestral polymorphisms），这些多态性通过不完全谱系分选（ILS）在古异齿亚纲和异齿类谱系中持续存在。总体而言，研究提出了一个用于研究深层辐射的系统发育基因组学框架，并表明A?+?P是一个可信的假说。
该文发表于《Cladistics》，围绕双壳纲深层系统关系中最具争议的节点之一——异齿总类（Heteroconchia）内部古异齿亚纲（Archiheterodonta）的系统位置——展开系统发育基因组学研究。研究背景在于，双壳纲是现生物种极其丰富的大类群，其主要谱系多形成于奥陶纪快速辐射时期，而这类古老快速辐射事件通常会留下复杂的基因树冲突信号，使深层节点即便获得高自举支持，也未必真实反映物种树。传统分类框架通常将古异齿亚纲与真异齿亚纲（Euheterodonta）合并为异齿亚纲（Heterodonta），但近年来部分结合分子标记、形态性状及超保守元件（ultra conserved elements, UCE）的研究却倾向于支持古异齿亚纲与古异齿类（Palaeoheterodonta）构成姐妹群，即A?+?P假说。由于古异齿亚纲此前一直缺乏基因组组装资源，其真实系统位置长期未获充分验证，因此开展本研究具有必要性：一方面可填补关键类群的基因组空缺，另一方面可借助大规模基因组数据检验深层分化中不完全谱系分选（incomplete lineage sorting, ILS）等过程对拓扑推断的影响。
研究人员首先构建了古异齿亚纲代表物种Cardita leana的首个基因组组装，并将其纳入包含64个双壳纲物种和4个外群的系统发育分析框架。基于BUSCO直系同源基因构建的蛋白质超级矩阵在最大似然（maximum likelihood, ML）、最大简约（maximum parsimony, MP）及多物种共祖模型（multi-species coalescent）分析中都恢复了异齿亚纲单系性，即C. leana与真异齿亚纲互为姐妹群。然而，进一步的基因一致性因子（gene concordance factor, gCF）分析揭示，这一高度支持的主树拓扑并不意味着基因层面的高度一致：只有42.5%的基因支持异齿亚纲，而27.1%的基因支持A?+?P，另有13.8%的基因支持真异齿亚纲 + 古异齿类（E?+?P）。这种冲突表明，古老节点的高支持度可能掩盖了大量基因树异质性。
为判断这种冲突是否源于常见的系统发育偏倚，研究人员分别提取支持异齿亚纲与支持A?+?P的基因子集，检测饱和效应、GC含量差异及位点异质性模型适配结果。结果显示，两类数据集均未表现出明显饱和，GC组成也无系统性差异，而采用更适配的位点异质模型LG?+?C10?+?R?+?I后，两类数据集中支持各自主拓扑的基因比例均有所下降，但并未出现某一假说因模型改进而被单方面强化的现象。因此，核苷酸组成偏差、替换饱和与矩阵异质性均不足以解释Heteroconchia内部的拓扑冲突。
在此基础上，论文重点检验了ILS与基因渗入（introgression）两种可能机制。通过对单基因树频率分布进行分析，并结合phytop方法估算冲突基因树来源，研究发现，在Heterodonta节点处，不一致基因树中有39.3%更符合ILS解释，而仅11.2%更符合基因渗入解释。这说明古老祖先多态性在谱系分化中长期保留，可能是造成该节点冲突信号的主要因素。为了进一步区分两种机制，研究人员利用分别支持异齿亚纲与A?+?P的基因集合进行分歧时间估算。理论上，若某些基因因ILS而偏离物种树，则这些基因反映的分化时间应早于真实物种分化事件；若由于渗入，则相关基因分化时间往往晚于物种分化。分析结果显示，支持A?+?P的数据集估算Heteroconchia分化于499 Ma，A?+?P节点分化于457 Ma；而支持异齿亚纲的数据集估算Heteroconchia分化于503 Ma，异齿亚纲节点分化于491 Ma。也就是说，支持异齿亚纲的基因给出了更深的节点年龄，且显著早于A?+?P，这与将这些基因解释为保留祖先多态性的ILS信号更为一致。即使移除Euheterodonta和Imparidentia的相关化石校准后，A?+?P节点仍显著年轻于异齿亚纲节点，说明这种时间差异并非单纯由先验校准设置驱动。
方法上，研究主要采用以下关键技术路线：其一，样本取自日本冈山大学Ushimado Marine Institute附近潮间带的Cardita leana成体个体，基于PacBio Sequel IIe获得HiFi长读长并以HiFiasm完成基因组组装，辅以Illumina RNA-seq进行基因预测和注释；其二，收集64个双壳纲基因组与4个软体动物外群基因组，利用Mollusca odb10与Metazoa odb10的BUSCO单拷贝直系同源基因构建超级矩阵，并通过IQTREE、TNT、RAxML、ASTRAL开展ML、MP和多物种共祖分析；其三，借助gCF、饱和检测、GC比较、位点异质模型重评估及phytop分析识别基因树冲突来源；其四，使用MCMCTree对不同拓扑支持基因子集及独立UCE数据集进行分歧时间估算与统计比较。
研究结果可概括如下。
The Cardita leana genome assembly
研究人员获得了C. leana首个基因组组装。PacBio测序共产生1?771?328条HiFi reads，最终组装长度为2.73 Gb，contig N50为178 kb。基于第二个个体Illumina数据的k-mer分析估算其基因组大小约2 Gbp，杂合率为2.83%。BUSCO评估显示，组装完整度在Metazoa odb10下为79.4%，在Mollusca odb10下为75.8%。Augustus预测47?988个基因模型。虽然组装连续性和完整性受较大基因组大小、高杂合度及材料限制影响，但该资源为古异齿亚纲系统发育研究提供了基础。
Phylogenetic placement of Archiheterodonta in the Bivalvia tree
利用2999个BUSCO基因构建的氨基酸超级矩阵，ML树中除Autobranchia外几乎所有深层节点均获极高支持，且C. leana稳定地与Euheterodonta构成姐妹群，从而支持Heterodonta单系。MP和多物种共祖分析得到一致结论。尽管如此，gCF分析揭示，Heterodonta节点仅有42.5%的基因支持，而A?+?P和E?+?P也分别得到27.1%和13.8%的基因支持，说明该节点存在显著的深层基因树冲突。
Evaluating signals of ILS and introgression during Heteroconchia diversification
单基因树统计显示，49.5%的基因支持Heterodonta，30.8%支持A?+?P，19.7%支持E?+?P。phytop分析进一步表明，Heterodonta节点中39.3%的冲突基因树可由ILS解释，仅11.2%可由基因渗入解释。随后，研究人员基于支持不同拓扑的基因子集进行贝叶斯分歧时间估算。结果发现，支持Heterodonta的基因所对应的节点年龄显著早于支持A?+?P的基因对应节点年龄，这一模式更符合祖先多态性长期保留并跨越连续分化事件的ILS解释，而非后期发生的渗入事件。
Inferring Heteroconchia relationships from another dataset
为验证结论稳健性，研究进一步重分析Li et al.（2025）公开的25%完整度UCE矩阵。该数据集中，多数决定性基因树因多系性而不支持三种候选拓扑中的任何一种，但在可比较信号中，A?+?P的支持比例高于Heterodonta。基于UCE子集进行的分歧时间估算同样显示，A?+?P节点显著年轻于Heterodonta节点；即使移除部分校准节点后，这一结果依然成立。由此，独立标记系统与BUSCO数据集呈现出一致模式，进一步加强了古老ILS参与Heteroconchia分化的解释。
讨论部分指出，双壳纲深层节点长期难解，与奥陶纪快速辐射及相关古老祖先多态性的保留密切相关。该研究表明，即便ML、MP及多物种共祖分析均给予某节点完全支持，若基因一致性分析显示大量基因支持替代拓扑，则该节点仍应被视为未完全解决。对于Heterodonta而言，常规系统发育偏倚并不能解释冲突，而分歧时间与phytop分析共同指向ILS是更重要的来源。研究同时指出，Autobranchia节点也表现出类似现象，提示古老ILS可能广泛存在于双壳纲早期分化史中。论文的意义在于提出了一套适用于古老快速辐射问题的分析框架，即将超级矩阵推断、基因一致性因子、冲突来源识别和分歧时间比较结合起来，以检验高支持拓扑是否真正代表物种树。
结论部分可译为：总体而言，研究表明，具有完全支持度的节点在更深入的分析下仍可能需要重新评估。研究结果提示，古异齿亚纲更可能与古异齿类互为姐妹群，而异齿亚纲不再获得稳固支持。尽管如此，这一结论仍需更多证据验证，因为多数蛋白编码基因仍支持Heterodonta，且Heterodonta与Palaeoheterodonta之间取样不平衡可能影响时间估计。未来若补充更多古异齿亚纲和古异齿类，特别是Trigoniidae的基因组数据，并将非编码序列纳入系统发育基因组学分析，或可进一步增强A?+?P假说的支持，或最终否定该假说。基于现有结果，Heterodonta不应再被视为一个已经完全解决的类群，而应被看作双壳纲内部仍存争议的系统发育假说。
