强首道屏障之外生殖隔离的演化：东南亚食植性瓢虫 Henosepilachna diekei 微异域宿主族分化中的成种过程

《Ecology and Evolution》：The Evolution of Reproductive Isolation Beyond a Strong First Barrier in Speciation Between Micro-Allopatric Host Races of a Phytophagous Ladybird Beetle, Henosepilachna diekei

　　

生殖隔离（reproductive isolation, RI）在成种过程中往往呈不均匀累积，部分屏障早期演化，其他屏障则在进一步分化后才出现。在宿主关联食植性昆虫中，分歧性宿主利用可产生强烈的栖息地隔离（habitat isolation），该屏障在成种早期演化并常导致向强生殖隔离的突然转变。然而，在此强早期生态屏障演化后，是否仍能累积额外的性隔离或合子后屏障仍不清楚。在本研究中，研究人员检验了东南亚食植性瓢虫 Henosepilachna diekei 宿主特化种群中的这一问题。研究人员聚焦于 Dicliptera–Mikania 族对，并与先前研究的 Mikania–Leucas 族对比较，后者代表两种假定的宿主族分化水平。结合实验室杂交与田间笼实验，研究人员调查并量化了四种潜在隔离因子：交配前隔离（栖息地隔离与性隔离）、合子后–孵化前隔离（卵孵化率降低）及合子后–孵化后隔离（F1 杂种不可活）。Dicliptera–Mikania 族对比同域 Mikania–Leucas 族对表现出更大的遗传分化。两族对均显示强栖息地隔离，但仅 Dicliptera–Mikania 族对显示出额外的较晚作用屏障，包括交配成功率降低、卵孵化率降低及 F1 杂种存活率降低。研究结果表明，即使在宿主族分化期间存在极强的栖息地隔离，额外的生殖屏障仍可演化。晚期作用屏障并未取代初始宿主关联屏障的重要性，而是可能累积并贡献于生殖隔离的稳定性。因此，晚期作用屏障的强度与动态可能取决于各宿主族对的演化轨迹，反映了宿主关联昆虫成种过程中多样的途径。

研究背景方面，生殖隔离（reproductive isolation, RI）的发展是成种的关键过程，其累积在时间上往往不均匀，一些屏障较早或较快出现，另一些则较晚或较慢出现，强度与重要性各异。理解成种不仅需要识别最先启动分化的屏障，还需考察后续是否有额外屏障演化及其出现的时间与节奏。尽管在识别基因流的首道屏障方面已取得实质进展，但从部分到强生殖隔离的过渡过程仍了解不足，尤其是在不同屏障累积并耦合的条件方面。基于初始驱动因素可作出一般预测：当成种由分歧性选择驱动时，预合子与外在合子后屏障预期先演化，随后才是内在合子后屏障，因为分歧性选择可直接产生减少基因流的生态或交配差异，而内在合子后屏障一般需要进一步遗传分化。这对食植性昆虫尤为相关，其分歧性宿主利用可直接产生若干早期 RI 形式：宿主植物同时作为食物资源、交配场所与产卵场所，宿主偏好分化可产生栖息地隔离与选型交配，而宿主关联适合度权衡可产生迁入者不可活及通过错配宿主偏好、宿主寻找能力或在亲本宿主植物上的表现而产生的适合度降低。然而，尽管对宿主关联分化有大量研究，强宿主关联隔离出现后 RI 的累积仍知之甚少。多数研究聚焦宿主偏好、栖息地隔离或迁入者不可活的起源，较少检验在强宿主关联隔离已演化后是否累积额外性、合子后–预合子或合子后屏障。现有例子表明宿主关联交配前屏障与迁入者不可活常较早出现，而后期屏障在时机与机制上变化更大；内在合子后–预合子或合子后屏障较不可预测，可能在更分化的宿主族、地理结构化种群或近缘种间出现，但在早期宿主族比较中常弱或缺失。这引出初始屏障强度的作用问题：若栖息地隔离不完全，残余族间接触可能允许针对迁移者或杂种的选择、加强或合子后屏障演化；若栖息地隔离近乎完全，基因流可能被强烈削减以致后期屏障受选择较弱或很少表达。因此，强早期栖息地隔离是否限制后期屏障演化机会，或额外性与合子后屏障是否仍能在宿主族持续分化中累积，仍不清楚。在食植性瓢虫 Henosepilachna diekei 中，先前对同域 Mikania–Leucas 族对的研究显示仅有极强栖息地隔离与迁入者不可活，无额外性或合子后屏障；而在地理隔离更高的 Dicliptera 族与 Mikania 族间，形态、生态与遗传暗示可能分化更深，为检验强早期栖息地隔离后是否仍能累积后期屏障提供了系统。

研究人员以东南亚食植性瓢虫 Henosepilachna diekei 的宿主特化族为对象，比较 Dicliptera–Mikania 族对与已发表的 Mikania–Leucas 族对，通过野外调查微空间分布、基于线粒体 ND2 基因的遗传关系分析、实验室与田间笼实验量化四类 RI 屏障：栖息地隔离（宿主偏好）、性隔离（非选择与雄性选择交配测试）、合子后–孵化前隔离（卵孵化率）、合子后–孵化后隔离（F₁ 幼虫在不同宿主上的生存与发育），并计算各屏障强度及总 RI，模拟不同环境干扰下栖息地隔离减弱时后期屏障的相对贡献，从而回答强早期宿主关联栖息地隔离是否伴随额外性与合子后屏障累积的问题。研究发现 Dicliptera–Mikania 族对遗传分化大于 Mikania–Leucas 族对，两者均有强栖息地隔离，但仅前者出现额外后期屏障（交配成功率降低、卵孵化率降低、F₁ 杂种存活率降低）；结论为即使存在强栖息地隔离，宿主族分化中仍可演化额外生殖屏障，后期屏障不取代初始宿主关联屏障的重要性，而是累积以增强 RI 稳定性，其强度与动态依赖各宿主族对演化轨迹，反映宿主关联昆虫成种的多样途径。该研究发表于《Ecology and Evolution》，补充了对食植性瓢虫成种连续体中 RI 动态的理解。

为开展研究，关键技术与样本来源包括：在印度尼西亚西爪哇 Bandung 与 Ciwidey 周边约 10×10 km² 区域进行野外调查，采集 Dicliptera canescens 上的 Dicliptera 族（D-race，来自 Patuha、Rancabali 种群）与 Mikania micrantha 上的 Mikania 族（M-race，来自 Padalarang、Bandung、Tambakruyung 种群）的 Henosepilachna diekei 成虫，建立实验室种群；基于线粒体 ND2 基因序列，以 Clustal W 比对、MEGA X 与 Arlequin 计算净遗传距离 D_xy 与固定指数 F_ST，用 Network 软件构建中位连接单倍型网络以明确 D-族与其他宿主族的系统发育地位；实验室开展宿主偏好双选实验评估栖息地隔离，非选择与雄性选择交配测试评估性隔离，处女雌雄个体跨族交配并记录卵批数量、孵化率与孵化时长以评估合子后–孵化前隔离，采用裂窝设计将同一母体的初孵幼虫分别饲喂两种宿主植物以评估合子后–孵化后隔离（F₁ 杂种生存与发育）；在 IPB University 温室设田间笼实验，采用分离与棋盘排列的宿主植物布局，释放标记处女雌雄个体观察有/无宿主植物下的选型交配、宿主忠实度与扩散距离；以广义线性模型（GLM）与广义线性混合模型（GLMM，以家族嵌套于雌性类型为随机效应）分析各 RI 指标差异，依据 Sobel and Chen 方法计算各屏障 RI 强度（取值范围 ?1 至 1）与总 RI 的序贯加和，并通过自举重采样（10,000 次）获得置信区间，模拟中度、强与极端环境干扰下栖息地隔离减半、减至四分之一与降至零时后期屏障贡献的变化，同时用已发表 Mikania–Leucas 族对数据做跨族对比较。

研究结果部分，各小节结论如下：

3.1 Microspatial Distribution of Beetles and Host Plants：野外调查显示 Mikania micrantha 分布于较低海拔湿润半开阔生境，Dicliptera canescens 分布于较高海拔湿润阴凉生境（如 Patuha 山约 1600 m），两宿主植物分布部分重叠但取食的瓢虫种群空间分离呈微异域（micro-allopatric），最近 M-族种群距 D-族种群约 5 km，无高海拔 M. micrantha 被取食记录。

3.2 Phylogenetic Position of D-Race：基于 ND2 序列，D-族 11 个个体共享唯一单倍型（LC940254），与 Java 岛其他宿主族单倍型明显分离；D-族与 M-族（西爪哇）的 F_ST=1，D_xy=0.0079，高于 L-族与 M-族（西爪哇）的 F_ST=0.3627、D_xy=0.0049，表明 Dicliptera–Mikania 族对遗传分化更强，但需注意单线粒体标记未必反映全基因组分化。

3.3 Host Preference (Habitat Isolation)：实验室双选实验显示两族均强烈偏好原生宿主，D-族个体 83%–92% 仅取食 Dicliptera canescens，M-族 86%–100% 仅取食 Mikania micrantha，GLM 显示“族”对偏好有强效应（p<0.0001），种群与性别无显著影响，RI 估算栖息地隔离接近 1（D-族 [0.92–1]，M-族 [0.81–1]）。

3.4 Non-Choice Mating (Sexual Isolation)：非选择交配测试中，雌性×雄性类型交互作用显著影响交配尝试与成功（p=0.0019；p<0.0001）；M-雌性方向 M×M 交配尝试与成功率高（0.95±0.05；0.90±0.00），M×D 显著降低（0.50±0.20；0.20±0.20）；D-雌性方向 D×D 与 D×M 尝试相近但 D×M 成功更低（0.58±0.06 vs 0.4±0.11）；M-族雄性对 D-族雌性交配尝试与成功均低，D-族雄性对两族雌性尝试无显著差异但族间交配成功降低；RI 呈方向性不对称，M-雌性方向 RI=0.636 [0.273–0.909]，D-雌性方向 RI=0.200 [?0.10–0.50]。

3.5 Egg Hatchability (Postmating-Prehatching Isolation)：GLMM 显示雌性类型影响每批卵数（p<0.0001），M-雌性跨/同族交配卵数高于 D-雌性（M×M 15.77±0.37；D×D 10.41±0.53），但孵化率在 D-雌性跨族 D×M 显著低于同族 D×D（0.104±0.338 vs 0.311±0.517，p=0.003），M-雌性方向 M×D 与 M×M 孵化率相近（0.430±0.471 vs 0.434±0.366）；D×M 孵化持续时间显著更长；RI 在 D-雌性方向为 0.489 [0.237–0.723]，M-雌性方向近零（0.002 [?0.077–0.082]）。

3.6 Larval Performance (Postmating-Posthatching Isolation)：非杂种幼虫（D×D、M×M）不接受替代宿主植物并在初龄饥饿死亡； reciprocal F₁ 杂种（D×M、M×D）可在两宿主存活但从 2 龄起适合度低于同族后代：在各自母本宿主上，M×D 成虫存活率显著低于 M×M（0.603±0.078 vs 0.890±0.035，p<0.0001），D×M 显著低于 D×D（0.178±0.097 vs 0.658±0.076，p=0.0028）；D×M 几乎无个体达成虫期；RI 在 D-雌性方向为 0.536 [0.339–1]，M-雌性方向为 0.211 [0.099–0.341]。

3.7 Mate Choice in the Absence and Presence of Host Plants：无宿主植物实验室选择测试中两族雄性交配近似随机，无显著选型交配；有宿主植物田间笼中两族均高度选型交配，仅少数族间交配，GLM 显示宿主植物存在对选型交配模式有显著效应（p=0.0096），宿主排列（分离 vs 棋盘）无显著影响；实地 RI 在 Mikania–Leucas 族对因强宿主忠实度从近零升至 1，在 Dicliptera–Mikania 族对升至 M-雌性 0.88 [0.79–0.96]、D-雌性 0.95 [0.89–0.99]。

3.8 Host Fidelity and Dispersal：田间笼中大多数成虫（85.9%）仅见于原生宿主植物，族间迁移少；GLM 显示出现位置受族强烈影响（p<0.0001），迁移方向受族与宿主排列影响（p<0.0001、p=0.0363），性别无显著影响；24 h 扩散距离 0.5–1.67 m，棋盘笼更高（p=0.0339），族内迁移频率 0.41–0.8 m，族间迁移 0–0.12 m。

3.9 Strength of the Reproductive Isolation：基线条件下总 RI 为 1，主要由栖息地隔离贡献；模拟栖息地隔离减半、减至四分之一与降至零时，M-雌性方向性隔离贡献上升（RI 分别 0.318、0.477、0.636），D-雌性方向合子后屏障（尤其卵孵化率 RI 分别 0.195、0.293、0.391）分布更均匀；Mikania–Leucas 族对仅强栖息地隔离（RI=1），其他屏障近零，但有宿主植物时因栖息地隔离导致实现性隔离急剧升高；各 RI 估算以标准化 RIO 框架报告。

讨论部分总结：研究人员在 4.1 The Evolution of Reproductive Isolation Beyond a Strong First Ecological Barrier 中指出，本研究显示在强宿主关联栖息地隔离后仍可累积额外后期屏障，这与“强栖息地隔离减少族间接触从而限制加强与新屏障耦合”的预期不同，更符合“强栖息地隔离削减基因流使行为、生理或遗传分化通过漂变与不兼容累积”的第二可能，Dicliptera 族的地理隔离历史限制当代基因流，使 RI 非经加强而经隔离累积，性隔离可能源于行为活跃度差异而非化学感受分化，合子后屏障可在异域种群较快演化；Dicliptera–Mikania 族对表明后期屏障不取代初始宿主关联屏障，而是与新屏障耦合增强与稳定已有栖息地隔离。4.2 Possible Mechanisms Underlying Later-Acting Barriers 中，性隔离可能来自 M-族高活跃度与 D-族被动行为的普遍行为差异，而非化学感受系统遗传固定分化；合子后–孵化前隔离（卵孵化率降低）可能源于少数突变导致的受精相关基因不兼容，表现为未受精卵与早期杂种死亡；合子后–孵化后隔离（F₁ 杂种不可活）可能兼具外在（宿主搜索效率降低）与内在（负上位性、染色体重组等）成分，不同机制强度各异。4.3 Dynamics of the Evolution of Reproductive Barriers in Phytophagous Ladybird Beetles 中，从成种连续体视角看，食植性瓢虫中栖息地隔离早期非线性累积，其他屏障随分化更线性进展； abrupt 从弱到强 RI 可能由地理分布变化、种群瓶颈、大效应突变或不兼容非线性累积驱动；跨寄主植物科的转变可能是重大生态转换，解释为何栖息地隔离常为首要屏障而合子后屏障仅部分族对演化；未来需比较更广分化程度的种群对以厘清分化程度、遗传与环境驱动对 RI 演化的相对影响及生态与突变顺序成种的角色。

研究结论部分翻译为：本研究表明，在东南亚食植性瓢虫 Henosepilachna diekei 中，强宿主关联栖息地隔离演化之后，仍可累积额外的生殖屏障。Dicliptera–Mikania 族对比先前研究的 Mikania–Leucas 族对遗传分化更大，且不仅显示强栖息地隔离，还显示额外的后期作用屏障（性隔离、卵孵化率降低、F₁ 杂种不可活）。相比之下，Mikania–Leucas 族对仅显示强栖息地隔离而无额外性或合子后屏障证据。这一比较提示，即使栖息地隔离非常强，后期屏障的累积仍有可能，但其对总生殖隔离的贡献可能主要在宿主关联栖息地差异存在时才有效。因此，这些后期作用屏障可能在成种早期、甚至宿主族间分化期间即已演化。强栖息地隔离减少族间接触与杂交，可能限制加强的机会；但同样的接触减少也削减基因流，使行为、生理或遗传分化通过漂变与不兼容在地理隔离或弱连接种群中累积，后期屏障仍可在栖息地隔离变强后演化，并非因频繁杂交受直接选择，而是首道屏障使宿主族在极少基因交换下持续分化。Dicliptera 族局限於南 Bandung 山区且与 M-族 ND2 遗传分化更大，符合更强地理隔离历史，当代基因流可能有限（需全基因组标记确认），在此微异域场景下通过加强发展 RI 较不可能，而迁移减少可促进遗传不兼容累积。这一对比意味着此类屏障的演化高度依赖特定成种轨迹：虽其他系统报道过宿主关联种群间合子后屏障，但在近缘食植性瓢虫 Henosepilachna vigintioctomaculata 复合种中种间比较未识别到，故 Dicliptera–Mikania 族对提示后期屏障不取代初始宿主关联屏障的重要性，而是通过与早期屏障（栖息地隔离）耦合来增强与稳定已有隔离。后期作用屏障的强度与动态可能取决于各宿主族对的演化轨迹，反映宿主关联昆虫成种过程中多样的途径。