环氧乙烷遗传毒性剂量-反应研究以指导癌症风险评估

《Environmental and Molecular Mutagenesis》：Investigation of Ethylene Oxide Genotoxicity Dose–Response to Inform Cancer Risk Assessment

　　

环氧乙烷（EtO）主要用作化学品制造中的中间体，少量用作医疗设备和食品的灭菌剂。它是一种直接作用的烷化剂，与细胞大分子（包括蛋白质和DNA）反应。EtO已被证明可诱导啮齿动物和人类肿瘤。DNA反应性被认为是其致癌性的作用模式（MOA）。本研究调查了EtO诱导的遗传损伤的剂量-反应，以告知癌症风险评估剂量-反应模型的生物学合理性。雄性及雌性B6C3F1小鼠（≥10只/性别/浓度）通过全身吸入暴露于0、0.05、0.1、0.5、1、50、100或200 ppm EtO（6小时/天，连续28天，7天/周）。通过在第28天测定网织红细胞（RET）和成熟红细胞（RBC）中突变型Pig-a表型的频率来评估致突变性。通过在第5天和第28天收集的血样中进行红细胞微核（MN）试验来评估细胞遗传损伤。EtO是一种相对较弱的遗传毒性物质，处理相关的Pig-a和MN频率增加主要在200 ppm处观察到。遗传损伤的曲棍球棒形剂量-反应可保守地解释为不超过具有单一斜率的线性反应。因此，如果EtO通过致突变性MOA发挥其致癌性，则在整个暴露范围内由单一浅线性斜率组成的癌症风险评估剂量-反应模型在生物学上是合理且一致的。

**论文解读：环氧乙烷遗传毒性剂量-反应研究对癌症风险评估的启示**

**研究背景与问题**
环氧乙烷（EtO）是一种直接作用的烷化剂，主要用作化学品中间体，少量用于医疗设备和食品灭菌。人类暴露来源包括内源性代谢（如肠道细菌产生的乙烯氧化）及外源性途径（如职业暴露、工业排放、吸烟等）。EtO与DNA反应形成多种加合物，其中N7-(2-羟乙基)鸟嘌呤（N7-HE-G）最为丰富，而被认为主要致突变的是O⁶-羟乙基鸟嘌呤（O⁶-HE-dG）加合物。EtO在啮齿动物和人类中均被证实具有致癌性，且其致癌作用模式（MOA）被认为是遗传毒性（致突变性）。

在癌症风险评估中，美国环保署（US EPA）和德克萨斯州环境质量委员会（TCEQ）均基于同一职业队列（NIOSH研究的灭菌器工人）的流行病学数据，但采用了不同剂量-反应模型，导致估算的百万分之一超额癌症风险相差近三个数量级（US EPA: 0.0001 ppb；TCEQ: 0.24 ppb）。US EPA采用两段线性样条模型（低剂量段陡峭、高剂量段平缓），而TCEQ采用标准对数线性Cox比例风险（CPH）模型（单斜率，整个暴露范围线性）。两种模型在统计上拟合程度相当，但关键问题在于哪种模型具有更强的生物学合理性。US EPA科学顾问委员会指出，任何合理的风险模型必须具有与观察数据一致且生物学上合理的剂量-反应形式。因此，研究人员旨在通过体内实验探索EtO遗传损伤的剂量-反应，为模型选择提供生物学依据。

**研究内容与结论**
研究人员使用雄性及雌性B6C3F1小鼠（≥10只/性别/浓度），通过全身吸入方式暴露于0、0.05、0.1、0.5、1、50、100、200 ppm EtO，每天6小时，每周7天，持续28天。在第28天检测红细胞Pig-a基因突变频率（网织红细胞RET和成熟红细胞RBC），并在第5天和第28天检测红细胞微核（MN）频率（作为细胞遗传损伤指标）。同时，在平行研究中测量了血红蛋白加合物和DNA加合物（N7-HE-G和O⁶-HE-dG）以确认EtO的系统暴露和靶组织暴露。

结果表明，EtO是一种相对较弱的遗传毒性物质：处理相关的Pig-a突变和MN频率增加主要出现在200 ppm暴露组，且增加幅度有限（Pig-a突变在雌性中显著，MN-RET在5天和28天均显著但仅约40%增加）。在低浓度（0.05–100 ppm）下，几乎所有终点均未观察到统计学显著变化。剂量-反应建模（使用PROAST软件，模型平均法）显示，整个浓度范围内（0.05–200 ppm）的遗传损伤响应可保守地描述为单一浅线性斜率，没有证据支持低剂量段存在陡峭上升（即US EPA两段线性样条模型所预测的形状）。此外，DNA加合物数据（Liu, Peng, et al., 2026）显示，非致突变性N7-HE-G加合物在所有浓度下均呈暴露依赖性增加，但致突变性O⁶-HE-dG加合物仅在≥50 ppm时被检测到（检测限低于1个加合物/细胞），且两种加合物的剂量-反应斜率均在较高浓度（≥50 ppm）时才变得陡峭，这与谷胱甘肽结合解毒途径饱和有关，而非低剂量段陡峭。

研究人员得出结论：EtO遗传损伤的剂量-反应模式支持单斜率线性CPH模型（即整个暴露范围内浅线性响应）的生物学合理性，该模型若用于EtO通过致突变MOA发挥致癌性的风险评估，则是一致的。

**关键技术与方法**
1. **全身吸入暴露系统**：使用1000升不锈钢-玻璃暴露舱，每天6小时，连续28天，分为两阶段（Phase I和Phase II），其中低浓度组（0.05和0.1 ppm）因Phase I分析干扰而重复，Phase II采用串联腔室设计以消除动物干扰。
2. **流式细胞术检测Pig-a突变**：使用Litron公司的MutaFlow试剂盒，通过抗CD24-PE、抗CD61-PE和抗CD45-PE抗体标记野生型红细胞及污染物，再用Anti-PE MicroBeads磁珠去除野生型细胞，富集突变表型红细胞，随后用核酸染料和计数微球进行流式分析（BD FACSCalibur），每只动物分析至少1亿个RBC和300万个RET。
3. **流式细胞术检测微核**：使用Litron公司的MicroFlow试剂盒，固定血样后，用抗CD71-FITC（标记RET）和抗CD61-PE（标记血小板）染色，再加碘化丙啶（PI）染色DNA，流式分析最多20,000个RET中的微核。
4. **剂量-反应建模**：使用PROAST 70.0版本（EFSA网络程序），采用模型平均法（四种连续响应模型族：指数、希尔、逆指数、对数正态），对统计学显著差异的终点进行建模，并计算模型平均曲线及95%置信区间。

**研究结果**
**3.1 系统暴露与DNA加合物**：血红蛋白加合物和N7-HE-G DNA加合物在所有EtO浓度下均呈暴露依赖性增加，证明EtO经吸入后系统可用且骨髓（Pig-a和MN的靶组织）暴露。O⁶-HE-dG加合物仅在≥50 ppm时检测到，且其剂量-反应斜率在高浓度时增大。

**3.2 Pig-a突变频率**：仅在200 ppm雌性小鼠中观察到Pig-a突变频率的显著升高（RET突变频率显著增加，RBC突变频率也显著但幅度较小），低浓度组无显著变化。阳性对照ENU（N-亚硝基-N-乙基脲）组突变频率大幅升高，确认实验条件有效。

**3.3 微核频率（第5天）**：200 ppm组小鼠的MN-RET频率显著升高（约40%），而低浓度组无变化。%RET在200 ppm时显著降低，提示细胞毒性。

**3.4 微核频率（第28天）**：200 ppm组MN-RET频率显著升高（约44%），且MN-NCE在雌性1–200 ppm和雄性200 ppm也显著升高。但低浓度雌性中MN-NCE的微小变化生物学意义需谨慎解读。%RET在200 ppm时显著降低，阳性对照CP（环磷酰胺）组MN-RET增加700%，确认实验敏感性。

**3.5 剂量-反应建模**：所有终点的剂量-反应曲线均显示单一浅线性斜率，无低剂量陡峭上升的证据。

**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究28天的暴露期足以达到DNA加合物稳态（小鼠、大鼠和人类中均如此），因此更长时间暴露不太可能改变剂量-反应模式。且EtO的遗传毒性较弱，主要在高浓度（200 ppm）才显现，这与之前Big Blue转基因小鼠骨髓（48周后）和肺（8周后）的研究一致。两段线性样条模型预测的低剂量陡峭斜率在生物学上不可信，原因包括：EtO是直接作用致突变剂，无需代谢活化，故高浓度时不会因代谢饱和而斜率变缓；且200 ppm（是致癌研究中肿瘤诱导浓度的两倍）未引起过度细胞毒性。此外，KRas基因突变研究（Parsons et al., 2013）显示，EtO诱导的突变可能源于预先存在突变的克隆扩增，而非直接致突变性，进一步支持EtO的致突变性较弱。

**结论**：遗传损伤（致突变MOA的第一关键事件）的剂量-反应模式支持单斜率浅线性CPH模型用于推导EtO吸入单位癌症风险的生物学合理性。