Ejectosporus trisporus的单菌体基因组学：一种不可培养的石蝇肠道真菌共生体

《Environmental Microbiology》：Single-Thallus Genomics of Ejectosporus trisporus, an Unculturable Stonefly Gut Fungal Symbiont

　　

微生物在全球生态系统中发挥重要作用，但其中大部分多样性，特别是真菌，由于培养和基因组表征的挑战而仍未被探索。毛菌类（Trichomycetes），作为水生昆虫专性肠道共生体的早期分化谱系，是这种‘微生物暗物质’的典型代表，因为大多数分类群无法在无菌培养（axenic culture）中维持。在此，研究人员首次呈现了Ejectosporus trisporus的培养非依赖性基因组组装，这是一种从加拿大红河国家城市公园的冬季石蝇（Allocapnia sp.）后肠中分离的不可培养的丝孢菌目（Harpellales）真菌。基于多重置换扩增（multiple displacement amplification）和Illumina短读长测序的单菌体基因组学方法，研究人员生成了一个29.3 Mb的基因组组装，其BUSCO完整度为76.6%，与现有的基于培养的丝孢菌目基因组相当。利用1241个保守直系同源基因的系统发育组学分析将E. trisporus置于与Zancudomyces culisetae和Capniomyces stellatus的一个高度支持的分支中，确认了其分类学位置。扫描电子显微镜进一步揭示了菌体（thalli）、三孢孢子（trichospores）和接合孢子（zygospores）的详细超微结构特征。本研究证明了单菌体基因组学对不可培养真菌的可行性，并为一种不可培养的毛菌类物种提供了首个基因组资源。研究人员的研究为未来早期分化真菌的大规模基因组研究奠定了宝贵基础，促进了对这些隐蔽肠道真菌的共生关系和生态作用的进一步探索。

**论文解读：Ejectosporus trisporus的单菌体基因组学——不可培养石蝇肠道真菌共生体的基因组资源**

**研究背景与问题**

微生物在生态系统中扮演关键角色，但真菌多样性因培养和基因组表征困难而大量未被探索。毛菌类（Trichomycetes）昆虫肠道专性共生体是典型的“微生物暗物质”，多数物种无法在实验室获得纯培养。目前，丝孢菌目（Harpellales）中仅有约20%的物种可培养，且基因组资源主要局限于可培养类群，来自蚊虫、蚋等双翅目宿主。不可培养类群（如石蝇、蜉蝣等宿主相关物种）的基因组数据几乎空白，严重限制了对其共生生物学、进化及生态功能的理解。因此，需要开发培养非依赖性基因组学方法，以获取这些隐秘真菌的基因组信息。

**研究内容与意义**

研究人员首次采用单菌体基因组学方法，对来自加拿大红河国家城市公园冬季石蝇（Allocapnia sp.）后肠的不可培养丝孢菌目真菌Ejectosporus trisporus进行了基因组组装和分析。成功获得了29.3 Mb的基因组，其BUSCO完整度（76.6%）与现有可培养类群相当。系统发育组学确认了其与Zancudomyces culisetae和Capniomyces stellatus的亲缘关系。扫描电镜揭示了菌体、三孢孢子和接合孢子的超微结构。该研究证明了单菌体基因组学对不可培养真菌的可行性，提供了首个不可培养毛菌类物种的基因组资源，为早期分化真菌大规模基因组研究奠定基础。论文发表在《Environmental Microbiology》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用培养非依赖性单菌体基因组学方法。样本来源：从加拿大红河国家城市公园收集冬季石蝇（Allocapnia sp.）若虫，从其后肠分离E. trisporus菌体簇。通过多重置换扩增（MDA）进行全基因组扩增，使用Illumina NovaSeq PE150平台进行短读长测序。对原始数据进行质量修剪后，进行从头宏基因组组装，通过CONCOCT进行宏基因组binning，利用EukCC识别真菌bin，最终获得真菌基因组组装。使用BUSCO评估完整度，AUGUSTUS进行基因预测，InterProScan进行功能注释。系统发育组学基于1241个保守直系同源基因，使用PHYling和IQ-TREE进行最大似然分析。

**研究结果**

**3.1 物种鉴定与形态学观察**
通过扫描电镜和光镜观察，确认了E. trisporus的菌体、三孢孢子（无性孢子）和接合孢子（有性孢子）的超微结构特征，发现未成熟与成熟接合孢子在形态上的差异（如接合孢子梗肿胀程度和孢子尖端弯曲方向），并观察到菌丝表面共存细菌细胞。

**3.2 培养非依赖性基因组测序与组装**
初始宏基因组组装显示真菌（26 Mb）、细菌（14 Mb）和动物门（2.1 Mb）序列。经生物信息学筛选后，真菌部分基本保留（25 Mb），细菌序列大幅减少（0.29 Mb）。最终基因组28.3 Mb，平均覆盖度134×，BUSCO完整度76.6%，与现有可培养丝孢菌目基因组（67.7%–76.4%）相当。

**3.3 基因组注释与系统发育组学分析**
最终基因组编码6162个蛋白编码基因，其中90.85%获得功能注释，鉴定出3176个Pfam结构域，2694个蛋白含固有无序区域，1393个含卷曲螺旋区域。成功恢复91.4%的丝孢菌目核心基因（1134/1241）。系统发育组学将E. trisporus与Z. culisetae和C. stellatus聚为高支持度单系分支，与先前系统发育研究一致。

**讨论与结论总结**

**讨论部分**：研究表明E. trisporus在冬季石蝇后肠中常见，其形态特征与原始描述一致，接合孢子发育存在变异。系统发育分析显示E. trisporus与石蝇宿主来源的C. stellatus及双翅目宿主来源的Z. culisetae形成单系分支，提示宿主关联与系统发育关系可能相关，但需更广泛采样验证。E. trisporus基因组大小（29.3 Mb）与近缘物种相近，但固有无序区域和卷曲螺旋蛋白比例（43.7%）更接近石蝇共生菌C. stellatus（45.9%），低于双翅目共生菌Z. culisetae（51.4%），可能反映宿主相关的基因组特征。当前毛菌类基因组研究完全依赖纯培养，但多数物种不可培养。单细胞/菌体基因组学可行，但存在扩增偏好等局限。本研究使用菌体级材料（含数十个细胞）和Phi29聚合酶，降低了扩增误差，最终BUSCO完整度与PacBio HiFi长读长组装相当，表明该流程有效。残留的细菌和动物序列可能源于数据库不确定性或水平基因转移。未来可结合长读长测序进一步改善组装质量。

**研究结论翻译**：E. trisporus的基因组组装证明了单菌体基因组学方法直接从环境材料生成高质量基因组的可行性和稳健性。这项工作标志着向扩大不可培养毛菌类物种基因组探索的重要进展，这些物种历来无法通过传统基于培养的测序方法获取。除了提供宝贵的基因组资源外，本研究还建立了一个可推广至其他共生真菌谱系的方法学框架，为探索其进化、生物学和生态角色开辟了新机遇。持续改进谱系特异性基准和测序策略将进一步增强该方法的能力，并加速对这些隐秘真菌类群的基因组发现。