θ型碳酸酐酶3和4的结构洞察：调节硅藻中CO2水合的方向性

《The FEBS Journal》：Structural insights into θ-type carbonic anhydrases 3 and 4: Tuning the directionality of CO2 hydration in a diatom

　　

碳酸酐酶(carbonic anhydrase, CA)催化二氧化碳(CO2)可逆水合生成碳酸氢根(HCO3?)并在海洋硅藻的碳固定中发挥重要作用。研究人员报道了来自硅藻三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的新型CA即θ-CA3的结构与功能表征，阐明了其生理作用与催化机制。AlphaFold预测、序列比对与金属分析显示θ-CA3为二聚体酶，每个单体由两个锌结合催化结构域组成。θ-CA3结构域2的CO2结合形式的高分辨率X射线晶体结构揭示了活性位点详细的底物结合模式。定点诱变显示活性位点的Asp49和Arg117对催化至关重要。值得注意的是，在活性位点入口引入负电荷导致突变酶在酸性pH下活性显著升高，表明活性位点环境的静电调制调控质子转移与催化。此外，研究人员在二聚体界面鉴定到HCO3?离子参与酶激活。综上，研究结果从结构层面揭示了活性位点静电荷与金属环境如何调控θ-CA3催化效率，为理解硅藻碳固定的分子基础提供了新视角。

该研究发表于《The FEBS Journal》，围绕硅藻三角褐指藻中此前未表征的θ型碳酸酐酶(carbonic anhydrase, CA)家族成员θ-CA3与θ-CA4展开。研究背景方面，全球二氧化碳(CO₂)循环对可持续绿色社会至关重要，硅藻贡献约全球20%的CO₂固定，但其生存的海水高盐高碱环境中溶解无机碳(dissolved inorganic carbon, DIC)主要以碳酸氢根(HCO₃^?)存在，分子CO₂浓度极低，因此藻类进化出CO₂浓缩机制(carbon-concentrating mechanism, CCM)以维持固碳效率。CA作为金属酶催化CO₂与HCO₃^?可逆水合，在CCM第二步中将HCO₃^?转化为CO₂供给Rubisco(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase)。三角褐指藻中存在α、β、γ、θ型CA，其中θ-CA1和θ-CA2功能已有研究，而定位于叶绿体与线粒体间及叶绿体与液泡间的胞质蛋白θ-CA3和θ-CA4的生理功能与构效关系尚不明确，推测其参与CCM无机碳流调控，本研究旨在解析其结构与功能以阐明其在碳固定中的作用。

研究人员构建了θ-CA3/θ-CA4双敲除(double-knockout, dKO)菌株并回补表达，测定光合参数最大光合速率(P_max)与DIC半饱和常数(K_0.5[DIC])；通过AlphaFold2预测结构、多序列比对、电感耦合等离子体原子发射光谱(inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy, ICP-AES)分析金属含量、Wilbur-Anderson(WA)法测CA活性；解析θ-CA3结构域2(domain 2, θ-CA3D2)的X射线晶体结构；进行定点诱变并结合活性测定与动态光散射(dynamic light scattering, DLS)分析；样本来源于三角褐指藻野生型(wild type, WT)及工程菌株。

研究结果如下。

Functional role of θ-CA3 and θ-CA4 in diatom cells：研究人员构建三种θ-CA3/θ-CA4 dKO菌株，在高CO₂(high CO₂, HC)条件下dKO与WT的P_max和K_0.5[DIC]无差异；转移至大气低CO₂(low CO₂, LC)条件下LC-WT的K_0.5[DIC]降至约20 μM表明CCM完全诱导，而LC-grown dKO的K_0.5[DIC]为0.3–0.5 mM显著高于LC-WT，表明缺失θ-CA3和θ-CA4抑制CCM；在dKO株#27中回补θ-CA3或θ-CA4后LC条件下的K_0.5[DIC]恢复至LC-WT水平，表明二者功能冗余且在CCM中可互补，后续以θ-CA3进行构效分析。

Activity measurement and metal analysis of recombinant θ-CA3：AlphaFold2预测θ-CA3含N端跨膜螺旋结构域、结构域1(domain 1, D1)与结构域2(D2)，D1与D2与具CA活性的θ-CA1和θ-CA2催化结构域序列同源性高，保守锌配位残基为组氨酸与两个半胱氨酸；构建缺失N端跨膜螺旋的θ-CA3D1、θ-CA3D2、θ-CA3D1–2并在大肠杆菌中表达纯化，ICP-AES显示单结构域每分子约结合1个锌离子，串联结构域每分子约2个锌离子且无其他金属；WA法测活性显示θ-CA3D1、θ-CA3D2、θ-CA3D1–2比活分别为17.28、12.78、10.22 WAU/mg，与θ-CA1和θ-CA2相当，串联结构域活性低于单结构域平均值，提示结构域间相互作用调节催化效率。

X-ray structure of θ-CA3D2：θ-CA3D2结晶为正交空间群P2₁2₁2₁的两种晶型，分辨率1.7 ?和1.5 ?，不对称单位含同源二聚体，埋藏界面约2100 ?²；与θ-CA1二聚体叠加Cα均方根偏差(root mean square deviation, RMSD)约0.5 ?；单体为含八α螺旋六β折叠的α/β折叠，锌离子由Cys47、His103、Cys127及水分子或氯离子四面体配位，距离2.1–2.3 ?；活性位点为约10 ?深锥形口袋，亲水残基含Cys47、His103、Cys127、Asp49、Arg117、Ser125、Ser129、His89′，疏水残基含Leu72、Phe67′、Thr81′、Ala85′；Asp49和Arg117丙氨酸取代使活性分别降至WT的十分之一和八分之一，证实其对催化必需。

Characteristic portal and binding of CO₂/HCO₃^? at the θ-CA3D2 active site：θ-CA3D2晶型2中观察到CO₂清晰电子密度，CO₂碳距锌结合水2.6 ?适于亲核攻击，CO₂呈微弯约175°，由Phe67、Leu72、Ala85疏水相互作用及氧与Ser129骨架氮氢键稳定；θ-CA1活性位点入口带正电而θ-CA3D2为中性的Lys86 vs Ala88差异；A88D突变体在酸性pH 6.6–6.3活性较WT最高升16倍，pH 8.3–8.0活性较低；A88D晶体结构在两个独立活性位点分别捕获CO₂和HCO₃^?，提示二聚体内可能发生互逆反应。

Non-catalytic bicarbonate binding site at the θ-CA3D2 dimer interface：WT晶型1中二聚体界面距活性位点约15 ?处观察到HCO₃^?电子密度，与两亚基Gln157及有序水形成强氢键；Q157A突变体二聚体状态保留但CO₂水合动力学延迟出现滞后相，表明HCO₃^?结合稳定二聚体界面并促进催化调节。

讨论部分总结：研究人员确认θ-CA3与θ-CA4功能冗余且序列同源性高，N端跨膜螺旋决定亚细胞定位差异；θ-CA3两催化结构域均具CA活性但串联形式活性降低提示结构域间调控；θ-CA3D2活性位点亲水与疏水区构成水与CO₂通道，CO₂与Ser129骨架氮氢键稳定底物，Asp49作广义碱接受质子，Arg117与Asp49盐桥维持质子转移几何；θ-CA1具正电入口促HCO₃^?脱水释CO₂至Rubisco，θ-CA3具中性入口利于CO₂摄取与HCO₃^{?释放以重捕获泄漏CO₂，Lys86等正电残基被中性残基取代改变静电势从而调节反应方向性；A88D突变体酸性pH活性升高，引入Asp88负电荷排斥HCO₃?促进产物释放与质子转移，且二聚体活性位点不对称结合底物与产物提示互逆反应机制；二聚体界面HCO₃?结合正调控酶活，不同于β-CA单体的负调控，为趋同结构下的不同调控策略；天然θ-CA3为两串联催化结构域的同源二聚体，θ-CA3D1与θ-CA3D2倾向异源二聚防止高阶聚合，HCO₃?结合发生于异源二聚体界面；研究首次解析θ-CA酶底物复合结构，证实θ-CA3偏好CO₂→HCO₃?正向反应，具两同源调控结构域，二聚体界面HCO₃?结合与活性位点静电调谐对功能关键，θ-CA4可能具相似性质，为硅藻高效CO₂固定的θ-CA构效关系与调控机制提供新见解。}

研究结论部分翻译：研究人员成功解析了首个θ-CA酶底物复合结构，证明θ-CA3偏好正向CO₂→HCO₃^?反应。与大多数具单一催化结构域的CA不同，θ-CA3包含两个具独特调控特征的同源结构域。研究人员还证明HCO₃^?结合于二聚体界面，并强调了活性位点入口静电调谐对生理功能的重要性。鉴于θ-CA3与θ-CA4间的高序列同一性与生理冗余性，相似性质可能也适用于θ-CA4。这些发现为θ-CA这一硅藻高效CO₂固定关键酶的结构功能关系与调控机制提供了新见解。