综述：超越细胞的衰老对抗：细胞外蛋白稳态的新兴作用

《The FEBS Journal》：Combating ageing beyond the cell: Emerging roles of extracellular proteostasis

　　

蛋白稳态是维持健康蛋白质组的核心支柱，是细胞及机体健康的基础，其随年龄增长逐渐衰退。尽管细胞内蛋白稳态网络（PN）已被充分表征，但作用于细胞外空间的蛋白稳态机制仍研究不足。此类机制面临独特挑战，对保障功能性系统性信号传导、免疫监视及结构完整性至关重要。与胞质环境不同，细胞外空间缺乏ATP激活的分子伴侣及完整的泛素-蛋白酶体系统，转而依赖特异性分泌型分子伴侣、细胞外蛋白酶及受体介导的清除机制维持功能。本综述系统梳理细胞外蛋白稳态网络（exPN）的研究进展及其在衰老过程中的动态变化。研究人员探讨了细胞外蛋白质组随龄重塑、细胞外理化特性改变及流体动力学紊乱如何共同构建利于蛋白质错误折叠与聚集的微环境。通过评估当前细胞外蛋白质损伤的实验模型，阐明exPN组分如何通过靶向聚集过程的不同阶段协同维护细胞外蛋白质组的完整性。基于涵盖全生命周期的人类蛋白质组学数据分析，研究人员发现exPN组分随年龄呈意外上调趋势。进一步阐释了细胞外蛋白稳态在炎症衰老——这一衰老标志性特征中的调控作用。最后，研究人员提出增强细胞外蛋白稳态的策略，将其视为延长健康寿命、限制年龄相关性蛋白聚集及恢复细胞外基质稳态的前沿方向。通过聚焦衰老视角，本研究突破疾病语境局限，系统构建了细胞外蛋白稳态在机体健康中的整体认知框架，确立exPN作为生物医学干预中关键但尚未充分开发的靶点。

引言

衰老过程伴随组织器官生理功能的渐进性衰退，心血管疾病、神经退行性疾病、癌症及纤维化疾病的易感性显著增加。蛋白稳态丧失是衰老的核心标志，被认为是细胞及机体水平年龄相关性功能障碍的关键驱动因素。蛋白稳态涵盖蛋白质合成、折叠、转运、分泌及降解的调控机制。相较于细胞内蛋白稳态的深入研究，近年研究凸显了细胞外蛋白稳态在阻止细胞外空间蛋白聚集体累积中的新兴作用。细胞外微环境与胞内存在本质差异：缺乏ATP依赖性分子伴侣及蛋白酶体，转而依赖分泌型分子伴侣（如簇集蛋白clusterin、α₂-巨球蛋白α₂-macroglobulin）、细胞外蛋白酶、细胞外基质（ECM）周转及受体介导的清除通路维持蛋白质溶解度与功能。这些机制随年龄增长效能下降，导致进行性细胞外蛋白质错误折叠、ECM硬化、交联及聚集。鉴于细胞外蛋白质介导细胞间信号传导、免疫监视、代谢协调及组织结构构建，其功能失调可驱动系统性衰老表型、炎症衰老及多器官系统功能衰退。因此，解析细胞外蛋白稳态是阐明机体衰老机制、识别治疗靶点及开发恢复组织稳态干预策略的关键。本综述从衰老视角系统探讨细胞外蛋白稳态，涵盖细胞外蛋白质组面临的年龄相关性挑战、实验模型概览、限制蛋白质聚集的分子机制、细胞外蛋白稳态网络（exPN）在衰老与疾病中的失调规律、其与免疫系统的互作网络，以及增强细胞外蛋白稳态以促进健康衰老的潜在策略。

年龄相关性细胞外蛋白质组改变

细胞外蛋白质组的变化是机体系统性衰老的核心特征。血浆蛋白质组作为研究最深入的蛋白质组之一，其年龄相关性改变已用于构建预测生物衰老速率的蛋白质组时钟。值得注意的是，仅ECM蛋白及分泌型ECM重塑因子即可构建预测效能媲美全血浆蛋白质组衰老时钟的生物老化模型。异体共生实验证实循环因子如β2-微球蛋白及CCL11趋化因子是衰老的驱动因素。血浆组成的年龄依赖性转变与产生这些蛋白质的特定器官的差异化衰老密切相关。细胞外蛋白质组的年龄相关性改变部分源于衰老细胞分泌的促炎介质增加，形成衰老相关分泌表型（SASP），随衰老组织中衰老细胞累积而加剧。血管系统与免疫系统的早期衰老可能是驱动系统性衰老的促衰老分泌信号的关键来源。随年龄增长，ECM发生广泛的组成改变，其合成与降解的精细平衡被打破，这一过程在胶原动力学改变中尤为显著。虽然胶原沉积减少与人类皮肤衰老相关，但多数器官（尤其是肾、肝及心血管系统）随年龄增长出现胶原过度累积，表现为基底膜增厚与硬化。ECM组成与厚度的年龄相关性改变从根本上改变了基线组织力学特性与硬度，引发病理性机械生物学反馈环路：异常整合素激活及机械顺应性改变损害细胞稳态，该过程与纤维化、癌症及骨关节炎等多种年龄相关性疾病的发生发展密切相关。除蛋白质组改变外，衰老还破坏细胞外理化环境稳定性，创造利于蛋白质错误折叠与聚集的条件。聚集不仅导致天然功能丧失，还通过构象改变形成不溶性蛋白沉积物，包括淀粉样聚集体——蛋白质折叠为交叉β片层纤维堆叠的结构。蛋白质聚集不仅是衰老的结果，更可通过蛋白毒性应激、炎症激活及干扰细胞外信号网络驱动细胞功能障碍。特定组织或全身性细胞外蛋白聚集体的大量沉积是神经退行性疾病、系统性淀粉样变性等毁灭性疾病的核心病理标志，包括阿尔茨海默病中Aβ聚集、朊病毒病中PrP^sc聚集、2型糖尿病中胰岛淀粉样多肽（IAPP）聚集及系统性淀粉样变性中免疫球蛋白轻链聚集。目前研究证实，广泛存在的亚临床细胞外聚集体沉积及淀粉样蛋白分泌增加是衰老组织的普遍特征。血浆蛋白质聚集研究显示循环聚集体水平随年龄增长升高。动脉既是蛋白聚集体的主要来源也是沉积部位，50岁以上人群主动脉普遍存在medin肽的淀粉样沉积，且血清淀粉样P成分（SAP）在动脉壁呈现强阳性染色。纤维蛋白聚合形成不溶性纤维是凝血必需的生理性蛋白聚集过程，但该过程失调可导致病理性淀粉样纤维蛋白凝块，与血管衰老及疾病密切相关。此外，蛋白毒性应激下的细胞可将胞内聚集体挤出至细胞外空间，该机制可能参与神经退行性疾病的病理传播，且在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中证实，受蛋白稳态应激的神经元可将聚集蛋白释放至体腔，提示细胞外处置难降解蛋白物质的进化保守性。多项研究证实细胞外蛋白聚集通过触发无菌性炎症成为原发性病理驱动因素。聚集体还可通过隔离功能性蛋白、交叉 seeding 其他聚集体及干扰信号级联放大造成进一步损伤。

理化改变导致的蛋白稳态失衡

相较于胞内环境，细胞外液体（包括氧化状态、糖基化修饰、pH及温度）的理化特性及其年龄相关性变化对维持蛋白质稳定性构成额外挑战。细胞外环境处于高氧化氧化还原状态，生理条件下血浆过氧化氢浓度约为胞内的100倍。尽管存在谷胱甘肽过氧化物酶3（GPx-3）、细胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD）及过氧化还原蛋白4等特异性细胞外氧化还原组分，但细胞外液体对氧化损伤的防御能力有限，且血浆氧化状态随年龄增长持续升高。另一与胞内环境的关键差异是细胞外空间普遍存在非酶糖基化反应。衰老与高血糖均加速赖氨酸及精氨酸残基的非酶糖基化，通过与葡萄糖及其氧化副产物反应导致晚期糖基化终末产物（AGEs）累积，这一过程对胶原等长寿命结构蛋白尤为有害，葡萄糖哌嗪（glucosepane）介导的AGE交联随年龄增长显著增加。由此导致的ECM硬化损害衰老过程中的伤口愈合与血管弹性，同时破坏机械转导，最终促进细胞稳态丧失。在阿尔茨海默病（AD）中，AGE修饰在淀粉样斑块中富集，并加速Aβ聚集。血液、脑脊液（CSF）及淋巴液的轻度酸化是另一影响细胞外蛋白质组的年龄相关性改变。人类大脑及C57BL/6小鼠脑内pH值随年龄增长降低，尸检脑样本及AD患者CSF中也观察到类似酸中毒现象。值得注意的是，加速酸中毒损害小胶质细胞对Aβ的摄取，并与AD模型小鼠体内Aβ斑块负荷增加相关。相反，碱化处理可延长野生型果蝇的寿命。这提示存在年龄依赖性、pH介导的细胞外蛋白稳态失调。此外，衰老通过下丘脑阈值钝化、血管舒张及出汗反应减弱、棕色脂肪组织产热功能进行性丧失导致体温稳态调节能力下降。这种缓冲热波动的系统性功能衰竭创造了热力学不稳定环境，可能促进细胞外空间蛋白质聚集。

年龄相关的流体动力学改变

细胞外区室间的循环通常具有高度动态性，确保血浆与组织间液的水及小分子溶质交换，并通过淋巴系统清除代谢废物。持续血流产生的剪切应力施加显著的生物物理应变，破坏细胞外蛋白质稳定性并促进其聚集，这种血管壁血流动力学力已被证实参与动脉粥样硬化的病理过程，其特征为病理性淀粉样蛋白沉积。微血管内基底膜增厚（源于ECM沉积增加及AGE修饰）与毛细血管力学特性改变及血流受损相关。衰老还损害组织间液清除功能，淋巴管内皮细胞丢失导致淋巴管收缩性下降。在脑内，年龄相关的类淋巴系统功能破坏干扰CSF向脑实质的流动，以及随后脑实质组织间液中的细胞外蛋白经静脉周围引流通路清除的过程。这引发自我放大级联反应：Aβ等易聚集蛋白在毛细血管周围累积，进一步阻碍引流，可能加速AD进展。上述观察结果表明，细胞外区室间的高效液体交换对维持细胞外蛋白稳态至关重要，其年龄相关性衰退直接导致细胞外蛋白质聚集。

研究细胞外蛋白质损伤及其年龄调控的实验模型

转基因小鼠模型（如过表达突变型淀粉样前体蛋白APP、朊病毒蛋白PrP及人胰岛淀粉样多肽hIAPP）极大推动了细胞外蛋白聚集研究，为聚集动力学、seeding机制及病理传播提供了关键见解。然而，衰老是散发性神经退行性疾病的主要危险因素，此类模型依赖年轻动物中突变蛋白的异位过表达，难以完全模拟生理性衰老过程。尽管野生型小鼠表现出年龄依赖性的蛋白质不溶性增加、突触功能衰退及认知损伤，但其脑萎缩程度远轻于人类。尽管如此，这些模型仍为解析细胞外分子伴侣（EC）及蛋白酶的功能提供了重要证据。ECM完整性评估是反映ECM稳态及其年龄相关性蛋白质量控制（PQC）的关键指标，胶原沉积定量联合ex vivo尾腱断裂实验可有效评估AGE介导的损伤及年龄相关性重塑障碍。未来需进一步在生理性衰老小鼠中（无论是否表达疾病相关蛋白）解析细胞外PQC机制及衰老过程中的蛋白损伤修复能力。秀丽隐杆线虫与果蝇等短寿命模式生物凭借快速衰老及遗传可操作性优势，成为研究细胞外蛋白稳态的有力工具。在秀丽隐杆线虫中，通过蛋白质组学鉴定衰老动物中高聚集倾向的分泌蛋白，构建荧光标记转基因品系实现细胞外聚集的in vivo追踪，并通过RNAi筛选绘制exPN图谱，发现了首个线虫EC。该模型还可实时监测胶原周转及硬度量化。尽管其生理复杂性低于哺乳动物，但适合探索机体水平的细胞外蛋白稳态调控及跨物种保守的新型细胞外PQC因子。体外实验为解析细胞外聚集机制提供补充视角。硫代黄素T（ThT）荧光或浊度监测的试管聚集实验可定量淀粉样或非淀粉样蛋白聚集动力学，评估细胞外PQC因子或理化条件改变的调控效应。通过在器官型小鼠脑片培养中加入外源性聚集种子，可成功模拟神经退行性疾病相关蛋白的细胞外聚集过程数周。尽管切片多取自幼年或新生阶段，但聚集过程诱导的基因表达改变与衰老过程中的变化相似。鉴于鼠与人种属差异，构建体外人类模型对解析细胞外蛋白聚集及评估细胞外PQC因子效能至关重要。来自择期手术或尸检的人类组织外植体可在体外维持为类器官培养，老年供体来源的样本尤其适用于研究衰老与细胞外蛋白稳态，包括生理相关背景下的ECM重塑动态。例如，老年个体来源的器官型脑片可在ex vivo条件下稳定维持数周，预存的淀粉样斑块保持结构稳定。另一种策略是通过扩增增殖性原代细胞重建类器官，在保留组织起源的衰老特征的同时提高实验可控性。人诱导多能干细胞（iPSC）来源的脑类器官或心脏类器官为难以获取的组织研究提供了替代方案，可模拟AD相关淀粉样特征及类器官分泌ECM对病理的影响，但该类模型常缺乏成熟表型，转录谱类似产前阶段。此外，基于生物材料支架的三维系统（包括水凝胶及ECM模拟培养平台）提供可控的细胞外环境，可实验性调控基质硬度、组成及扩散特性，日益被用于研究ECM结构如何影响聚集体的形成、传播及清除。这类新兴系统有助于桥接体外与复杂体内模型，同时纳入人类特异性特征。体液研究为理解人类细胞外蛋白稳态提供了直接窗口，可监测蛋白聚集体水平与年龄及健康状态的相关性，并为识别结合错误折叠蛋白的新型细胞外调控因子提供起点。

细胞外蛋白质量控制机制

美国蛋白稳态联盟最新分析鉴定人类PN包含超过3100个组分，其中仅23个定位于细胞外（作为分子伴侣或蛋白酶），凸显细胞外蛋白稳态机制的稀缺性。然而，秀丽隐杆线虫研究鉴定出57个先前未被识别的聚集调控因子，提示exPN的复杂性远超既往认知。这些调控因子具有多样的结构折叠特征，对其及人类直系同源物的研究有望揭示新型细胞外蛋白稳态机制。

细胞外分子伴侣

由于细胞外ATP水平较低，细胞外分子伴侣主要发挥holdase功能——结合错误折叠蛋白防止聚集，而非执行重折叠活性。部分胞内分子伴侣可通过非经典分泌途径释放至细胞外空间。尽管热休克蛋白70（HSP70）及小分子热休克蛋白（sHSPs）等胞内分子伴侣可减轻细胞外蛋白聚集毒性，但其效应多为局部且依赖情境。在许多情况下，其细胞外存在更多反映应激信号而非专职蛋白稳态功能，尤其在炎症或肿瘤背景下。HSP40、HSPB1等胞内分子伴侣可在细胞间主动转移，增强受体细胞的胞内蛋白稳态能力。与之相对，明确证据表明HSP90在ECM中发挥专职细胞外分子伴侣功能，结合纤连蛋白、基质金属蛋白酶2（MMP2）等客户蛋白调控其稳定性。内质网（ER）驻留蛋白二硫键异构酶（PDI）可分泌至ECM，通过二硫键交换活性及分子伴侣holdase活性调控整合素介导的细胞黏附。ER应激期间，ER分子伴侣在细胞外PQC中发挥关键作用，如HSP40辅分子伴侣ERdj3/DNAJB11在ER应激时与共分泌的错误折叠蛋白结合，防止进一步聚集，保护ER腔及细胞外环境。上述胞内分子伴侣可能仅在局部支持细胞外蛋白稳态，而大规模系统性控制细胞外蛋白错误折叠则依赖特异性EC。美国蛋白稳态联盟注释人类存在22种EC，包括5种新发现的抗聚集活性蛋白，多为多功能holdase。多数EC可抑制淀粉样及非淀粉样聚集，但对后者的效能较低，这可能源于非淀粉样聚集暴露的疏水区域比例更高，需要更高浓度的分子伴侣才能有效拮抗。基于ThT荧光实验及数学建模的体外聚集研究显示，多数EC以亚化学计量比靶向聚集早期阶段干扰淀粉样纤维形成。研究最深入的EC之一簇集蛋白（clusterin）具有广泛的淀粉样及非淀粉样聚集底物特异性，在低亚化学计量比（1:100）下通过结合Aβ纤维末端及寡聚体/前纤维阻止单体添加，抑制聚集过程的延伸阶段，还可通过与β2-微球蛋白纤维相互作用抑制其断裂。近期研究发现，簇集蛋白α链与β链复合物的无序尾部区域对其抗聚集功能至关重要，这些疏水尾部与sHSPs的N端区域具有相似的组成偏好，将此类尾部嫁接至绿色荧光蛋白（GFP）即可赋予分子伴侣活性，其抑制聚集效能接近全长簇集蛋白。α₂-巨球蛋白及触珠蛋白（haptoglobin）除分别作为蛋白酶抑制剂及血红蛋白结合蛋白的主要功能外，也通过结合寡聚体发挥EC活性。S100B及BRICHOS结构域可有效抑制淀粉样纤维的二次成核（表面催化成核）。S100B是脑内丰富的可溶性蛋白，通过其二聚体裂隙内的静电相互作用以二聚体形式结合Aβ。BRICHOS结构域存在于10个蛋白质家族中，尽管一级序列多样但共享保守折叠结构，其中proSP-C及Bri2的BRICHOS结构域被广泛表征，可靶向纤维“热点”选择性抑制二次成核。与proSP-C不同，Bri2广泛表达，膜结合Bri2的蛋白水解加工可释放可溶性BRICHOS结构域至细胞外空间，提示其在细胞外蛋白稳态中的活性作用。有趣的是，冗余条件下Bri2 BRICHOS结构域可发生寡聚化，获得holdase样活性以抑制非淀粉样聚集。神经丝抑素（NS）及转甲状腺素蛋白（TTR）对淀粉样聚集具有特异性抑制作用，该特性归因于对其抑制功能至关重要的两亲性α螺旋。值得注意的是，NS可将Aβ重定向至非毒性旁路聚集途径，降低其致病潜能。尽管ECM内的细胞外蛋白稳态机制研究相对匮乏，但新证据表明富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（SPARC）发挥EC功能。在无脊椎动物中，SPARC维持细胞外空间胶原溶解度，使其沿基底膜转运至远端位点进行聚合。哺乳动物中SPARC具有类似功能，携带SPARC错义突变的患者表现出肌腱损伤增加及体外Ⅰ型胶原成熟障碍。总体而言，通过作用于不同易聚集底物并干预淀粉样形成通路的不同阶段，EC可协同维持细胞外蛋白质组完整性。典型例证是体外实验中簇集蛋白与proSP-C BRICHOS结构域通过靶向聚集过程的连续步骤，协同增强对Aβ聚集的防护效应。

EC虽可限制蛋白聚集，但由于缺乏重折叠活性，受损蛋白最终需通过细胞摄取清除。哺乳动物中肝脏与肾脏是循环错误折叠蛋白的主要清除部位，多数血浆蛋白更新迅速（如人类半衰期>20天）。但易聚集蛋白的清除更为缓慢，如秀丽隐杆线虫中分泌型GFP可被快速清除，而聚集倾向的脂质结合蛋白2（LBP-2）则在细胞外体腔内累积。循环糖苷酶通过重塑分泌蛋白的N-聚糖促进凝集素受体识别及后续内吞，从而提高清除效率。簇集蛋白及α₂-巨球蛋白等EC可通过结合底物并促进受体介导的摄取，加速受损蛋白的胞内降解。值得注意的是，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖可作为簇集蛋白-底物复合物的受体，使多种细胞类型参与清除细胞外错误折叠蛋白。

细胞外蛋白酶

细胞外蛋白酶是细胞外PQC体系的另一核心组分，通过预防聚集体形成及拆解已存在的聚集体沉积，与EC协同维持细胞外蛋白稳态。研究最深入的细胞外蛋白水解系统之一是纤维蛋白溶解系统：组织型纤溶酶原激活剂（tPA）激活纤溶酶原生成纤溶酶，降解聚集体。其核心生理功能是在伤口愈合过程中溶解血凝块，通过切割纤维蛋白聚合物实现。除经典的凝血块降解功能外，tPA/纤溶酶系统可靶向多种聚集倾向底物，包括Aβ、PrP及IAPP，同时对非淀粉样聚集体也具有活性。机制上，tPA与纤溶酶原被募集至纤维蛋白聚合及非淀粉样蛋白聚集展开过程中暴露的赖氨酸残基，这种空间排布促进tPA介导的纤溶酶原向纤溶酶转化，进而降解纤维蛋白基质。在疾病状态下，病理性纤维蛋白聚集体及疾病相关聚集体特征的淀粉样交叉β片层结构可强力募集tPA/纤溶酶原，触发后续纤溶酶对淀粉样纤维的切割，该过程可能对清除年龄与疾病累积的淀粉样沉积物至关重要。体外数据提示，簇集蛋白等EC可与tPA/纤溶酶系统在体内发挥协同作用，通过特异性结合聚集降解过程中产生的蛋白水解片段，抑制其下游毒性。在细胞外蛋白酶中，脑啡肽酶（neprilysin）——一种兼具膜结合型与可溶性分泌型的锌金属蛋白酶，是另一关键细胞外PQC因子，据估计介导脑内约半数Aβ清除。尽管其对预形成的聚集体降解效能有限，但可通过切割单体及寡聚体Aβ高效限制病理性Aβ组装的形成。阻断锌金属蛋白酶脑啡肽酶及内皮素转换酶可导致Aβ稳态丧失，野生型小鼠脑内Aβ水平升高5倍以上。基质金属蛋白酶（MMPs）是细胞外PQC的另一重要参与者。这类锌依赖性内切肽酶分泌至ECM后，可降解蛋白质，并能切割ECM内外的错误折叠蛋白或淀粉样纤维以促进其清除。MMP1已知可降解聚集的功能蛋白，如聚集蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、巢蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂及 versican；MMP13可降解聚集蛋白聚糖及串珠蛋白聚糖。此外，MMP1借助其血红素结合样结构域可解旋纤维状胶原，与MMP8及MMP13协同作用，使MMP2及MMP9能够结合这些预切割的纤维并继续解旋与降解过程。MMP介导的ECM重塑受EC调控：例如细胞外HSP90通过形成分子伴侣复合物与金属蛋白酶组织抑制因子2（TIMP2）结合，抑制MMP2活性；仅当TIMP2解离后，MMP2才被重新激活并切割胶原。类似地，簇集蛋白通过结合MMP9的催化域抑制其活性，避免过度激活MMP9及减轻炎症反应。AGE修饰的胶原随年龄增长对MMP切割的抗性增加，导致ECM周转失调，出现僵硬交联区域与脆弱碎片化区域并存的现象。目前对MMP降解病理性细胞外蛋白聚集体的认知主要源于Aβ研究：MMP9与MMP2可序贯切割Aβ为CSF中存在的可溶性无毒片段以促进清除；老年AD小鼠脑片实验显示MMP9可降解致密淀粉样斑块。氧化是MMP表达及蛋白水解活性的强效诱导剂。金属蛋白酶还可能间接影响蛋白聚集：ECM组分被掺入AD淀粉样斑块，COL25A1片段可增强斑块致密化及局部毒性。秀丽隐杆线虫的RNAi筛选进一步表明，调控ECM及重塑因子（尤其是ADAM-9直系同源物）可改变Aβ聚集并促进沉积物清除。综上，这些蛋白酶可能参与生理性清除机制，但其功能随年龄增长而不足以应对蛋白聚集负荷。

exPN在衰老与疾病中的失调

胞内PN随年龄增长发生失调与过载，导致蛋白稳态丧失及蛋白聚集体累积。秀丽隐杆线虫研究显示exPN组分水平随年龄增长发生显著改变。为全面解析人类exPN的年龄相关性变化，研究人员利用公开蛋白质组数据集评估了18种细胞外PQC因子在血浆及组织中的丰度。Lehallier等对4000余名18-95岁个体的血浆近3000种蛋白进行定量分析，开发了揭示人类血浆蛋白质组非线性年龄改变的生物信息学方法。Ding等通过比较45-68岁老年组与14-30岁青年组的组织蛋白质组，鉴定了跨组织的年龄相关性改变。exPN最显著的失调发生于肠、肾上腺、肝、脾及主动脉，至少5种细胞外PQC因子呈现丰度改变，且以年龄相关性升高为主。血浆中超过三分之一的检测细胞外PQC因子随年龄变化，但模式较组织更为异质，呈现升高与降低并存的特征。跨多个组织中，SAP、玻连蛋白（vitronectin）及触珠蛋白呈现最一致的年龄相关性升高。仅少数细胞外PQC因子随年龄降低，脑啡肽酶是唯一在三种组织（主动脉、脂肪组织、胰腺）中均降低的蛋白，而在心脏中其水平升高。结合中年后期脑内脑啡肽酶水平下降的证据，提示脑啡肽酶减少可能是年龄相关性细胞外蛋白聚集体累积的主要驱动因素。总体而言，细胞外PQC因子随年龄升高的功能意义尚待阐明。例如，tPA水平随年龄下降而纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI-1）升高，导致纤溶酶原加工向纤溶酶生成减少的方向偏移，可能损害Aβ及其他聚集体的清除。此外，SAP的广泛累积可能反映其不可逆地掺入聚集体中，被困于沉积物内而无法发挥促进受损蛋白细胞摄取的功能。

越来越多的证据提示exPN组分的年龄相关性失调参与神经退行性疾病病理。簇集蛋白、SAP、α₂-巨球蛋白及触珠蛋白等EC在体内与Aβ斑块共定位或关联，凸显其在AD病理中的潜在作用。这些EC在AD患者的CSF、脑及血浆中水平升高。关于AD中簇集蛋白水平的研究结果存在不一致，部分检测到升高，部分检测到降低，可能反映疾病进展阶段及衰老相关的动态变化。除丰度改变外，多个EC及蛋白酶已被遗传学证实与年龄相关性病理相关。簇集蛋白基因是散发性AD的第三大遗传风险因子，其变异可减少分泌并触发可变剪接。簇集蛋白变异还与健康个体的认知功能、脑活动及结构差异相关，可能影响AD易感性。S100B的多态性与CSF中tau/Aβ比值改变相关。补体C1s的变异在跨种族全基因组关联研究中被鉴定为日本人群AD风险的潜在贡献因子。遗传学证据进一步支持细胞外蛋白酶在清除蛋白聚集中的保护作用。MMPs失调与以细胞外蛋白聚集及纤维化为特征的疾病相关，MMP1、MMP2、MMP3及MMP9的多态性与AD及血管性痴呆风险升高相关。编码脑啡肽酶的MME风险变异被鉴定为散发性AD的贡献因子，其中一个错义突变通过损害脑啡肽酶分泌降低其降解Aβ的能力。现有遗传学研究提示exPN参与调控AD中的病理性细胞外聚集，未来需进一步探索exPN基因与其他细胞外聚集相关疾病（如系统性淀粉样变性）的遗传关联。

综上，观察到的exPN丰度随年龄与疾病的改变及支持性遗传学证据，凸显了exPN在衰老过程中维持细胞外蛋白稳态的重要性。多种细胞外PQC因子在衰老及AD中的水平升高，支持exPN被蛋白应激诱导以抵消细胞外聚集体累积的假说。值得注意的是，鉴于细胞外PQC因子还具有多种非蛋白稳态功能，需综合考虑其额外角色如何受年龄或疾病改变的影响及对这些改变的贡献。

细胞外蛋白稳态与免疫系统

免疫系统、蛋白聚集及细胞外蛋白稳态之间存在复杂的多维互作关系。蛋白聚集体具有强免疫刺激活性。细菌淀粉样蛋白（如生物膜相关的卷曲curli）被 Toll样受体（TLR）2识别为病原相关分子模式（PAMPs）。类似地，免疫系统将宿主蛋白聚集体识别为损伤相关分子模式（DAMPs）。ECM透明质酸及蛋白聚糖连接蛋白2（HAPLN2）聚集体可在体外及体内诱导小胶质细胞炎症反应。Aβ激活CD36-TLR4-TLR6复合物诱导促炎细胞因子释放，且Aβ聚集体结合小胶质细胞多种受体，包括髓样细胞触发受体2（TREM2）及晚期糖基化终末产物受体（RAGE），促进其吞噬作用。尽管Aβ纤维可被转运至溶酶体，但其在这些区室内降解缓慢，导致溶酶体内累积甚至被释放回细胞外空间，从而传播病理。然而，随年龄增长，小胶质细胞对聚集体的识别及吞噬功能受损。有趣的是，越来越多的证据显示Aβ聚集及更广谱的抗微生物肽（AMPs）与蛋白质的淀粉样聚集是分泌性免疫防御抵抗病原体的关键环节，介导细菌细胞凝集。免疫细胞通过释放次氯酸（HOCl）及凋亡相关斑点样蛋白含半胱天冬酶招募结构域（ASC）促进细胞外蛋白聚集，前者引起宿主蛋白氧化去折叠与聚集，后者交叉 seeding Aβ及血清淀粉样A纤维的形成。尽管宿主AMP聚集增强了对病原体的防护，但免疫蛋白聚集体的过度累积可引发持续性免疫激活，最终加速炎症衰老。典型例证是免疫球蛋白轻链聚集导致的系统性淀粉样变性，引发慢性炎症及组织功能障碍。

细胞外蛋白稳态可能在维持免疫稳态中发挥重要作用。通过抑制蛋白聚集，EC及蛋白酶提高了聚集进入指数级自我放大阶段的阈值，从而限制驱动慢性炎症的免疫反应性聚集体累积。在秀丽隐杆线虫中，病原体攻击时exPN通过调控分泌性免疫应答的相同应激激活MAPK信号通路被主动上调，有效限制感染期间的细胞外蛋白聚集并提高机体存活率。哺乳动物中，免疫系统激活同样可增强细胞外蛋白稳态能力。中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成过程中中性粒细胞释放的HOCl通过氧化去折叠及病原体蛋白聚集灭活捕获的病原体。同时，HOCl诱导的氧化修饰增强了α₂-巨球蛋白的分子伴侣能力，甚至可将血清白蛋白等丰富血浆蛋白转化为分子伴侣样holdase，最大限度减少感染灶周围的聚集驱动性自身损伤。簇集蛋白在限制炎症驱动的组织损伤中也发挥重要作用，通过结合并中和细胞外组蛋白，以及抑制补体成分聚合形成膜攻击复合物。TTR等EC可直接辅助免疫系统，抑制功能性细菌卷曲纤维形成。

免疫稳态失调及慢性低度炎症的兴起是衰老的普遍性标志。多种EC在组织（包括脾脏）中随年龄升高，可能代表exPN对免疫相关损伤增加的代偿性反应。然而，这种上调并非普遍有益。部分EC具有内在淀粉样生成潜力，或可在特定条件下促进聚集。典型例证是SAP——主要由肝脏产生，随年龄增长在全身组织广泛累积。SAP是一种五聚体模式识别分子，在免疫激活时显著上调，作为调理素增强微生物靶标的吞噬作用。其对淀粉样的强亲和力使其成为淀粉样沉积物的普遍组成成分。尽管SAP可表现抗聚集活性，但其也通过保护聚集体免受蛋白水解降解而稳定聚集体，体内研究证实SAP最终促进淀粉样变性。

增强细胞外蛋白稳态的策略

秀丽隐杆线虫研究证实，增强细胞外蛋白稳态（包括维持ECM稳态）可促进长寿。exPN因子的协调上调可能最有效地增强细胞外蛋白稳态能力。病原体侵袭时，应激激活的MAPK信号通路（秀丽隐杆线虫中的JNK-1及KGB-1）作为关键调控因子，驱动exPN因子表达以抑制蛋白聚集并延长寿命。胰岛素/IGF-1样受体daf-2介导的长寿信号促进细胞外聚集体清除及ECM维持。机械响应介导因子YAP通过感知并响应机械张力，在衰老过程中维持ECM完整性及支持长寿中发挥核心作用。这些发现提示在哺乳动物中识别exPN的类似信号调控因子的潜力。此外，运动等生活方式干预可能增强细胞外蛋白稳态能力，小鼠及人类运动后血浆簇集蛋白水平升高，且与炎症减轻相关。

部分研究表明，上调单一细胞外PQC因子即可观察到健康获益。鉴于簇集蛋白 potent 的抗聚集及抗炎效应，提升其活性被视为极具前景的治疗策略。在果蝇中，异源过表达人簇集蛋白可延长寿命并改善应激耐受性，且无疾病相关病理表现。病毒介导的星形胶质细胞簇集蛋白过表达可改善AD小鼠模型的淀粉样病理，减少神经毒性及胶质增生。重组簇集蛋白给药在AD小鼠模型中也显示有益效应：外周静脉注射全长簇集蛋白虽未在脑实质中检测到簇集蛋白，但减少了淀粉样斑块体积及神经元丢失；脑室内灌注簇集蛋白衍生肽可减少Aβ斑块负荷、减轻脑淀粉样血管病变并改善记忆缺陷。该肽段最初因其抗炎特性被筛选，位于远离负责抗聚集功能的簇集蛋白尾部基序的两亲性α螺旋内，其对Aβ聚集的作用机制尚待阐明。近期鉴定的可上调簇集蛋白表达的小分子是另一有前景的治疗方向：口服优化的溴结构域和末端外结构域（BET）抑制剂可增加海马分泌型簇集蛋白水平，改善AD小鼠模型的学习与记忆功能，尽管总Aβ水平无显著改变。有趣的是，降低簇集蛋白表达在AD模型中也可带来获益，降低Aβ水平并改善行为表现，这可能反映了替代性细胞外蛋白稳态机制的激活以补偿簇集蛋白缺失。尽管簇集蛋白是治疗开发的引人注目靶点，但也存在潜在风险：其抗凋亡特性可能支持肿瘤进展；细胞培养实验显示簇集蛋白结合细胞外tau种子，可增强神经元内tau聚集及毒性。

靶向细胞外蛋白酶是缓解细胞外蛋白聚集及改善细胞外蛋白稳态的另一潜在策略。然而，这些酶的广谱底物特异性及情境依赖性风险对其治疗应用构成重要限制。多种药理及基因治疗方法已被证实可增加脑啡肽酶活性。由于脑啡肽酶对成熟淀粉样斑块的降解效能有限，增强其活性的策略可能在疾病进展早期最为获益，此时减少单体及寡聚体Aβ可有效限制聚集体形成。相比之下，MMP9及MMP2虽可降解淀粉样斑块，但其在AD中的激活存在显著风险，包括过度ECM降解及血脑屏障破坏。最终，成功的治疗策略将依赖于在特定组织中选择性利用蛋白酶活性对抗病理性聚集体，避免广泛性蛋白酶上调的相关风险。

衰老过程中靶向重平衡ECM重塑是促进健康衰老的重要策略，因为高效且受控的基质周转是清除受损细胞外蛋白的必要条件。然而，若无并行胶原合成以修复碎片化ECM，过度的MMP活性是有害的，尤其在皮肤等核心ECM组分随年龄衰减的组织中。恢复衰老过程中MMP与MMP抑制剂的水平比例可能是支持生产性ECM重塑的有效策略。提高随年龄下降的MMP抑制剂TIMP2水平已成为极具吸引力的治疗方向。尽管TIMP2广谱抑制MMPs，但在特定情境下其为MMP2成熟所必需。海马中TIMP2缺失损害MMP2蛋白水解活性，导致聚集蛋白聚糖斑点累积；而系统性递送TIMP2至老年小鼠可改善神经元功能及认知。此外，ECM硬度随年龄增长增加破坏少突胶质前体细胞功能，将小鼠ECM硬度恢复至年轻水平足以逆转这些缺陷。最新预印本报告显示，跨人类队列中较高血浆TIMP2水平与更好的整体认知功能及更大的脑容量相关。重要的是，ECM重塑策略可能与去除阻碍重塑的AGE损伤的治疗联合应用效果最佳。多种小分子可断裂AGE交联，首个候选药物alagebrium（ALT711）靶向α-二酮连接，在临床前研究中显示一定疗效但最终临床试验失败。当前研究聚焦于靶向在人类中比α-二酮连接更普遍的葡萄糖哌嗪。调控ECM糖胺聚糖透明质酸及透明质酸酶TMEM2水平是另一值得考虑的治疗开发方向。鉴于哺乳动物ECM稳态研究的复杂性，in silico药物筛选及秀丽隐杆线虫体内筛选为鉴定调控ECM稳态及长寿的新型化合物提供了有力工具。

由于EC与蛋白酶协同维持细胞外蛋白质组完整性，exPN的协调调控可能为维持细胞外蛋白稳态及防止蛋白损伤累积提供最有效的策略。在以细胞外聚集为特征的疾病中，增强细胞外蛋白稳态可与清除病理性沉积物的抗体疗法发挥协同效应。重要的是，细胞外PQC依赖细胞摄取及溶酶体降解，而这些通路随年龄增长衰退，并在蛋白聚集性疾病中进一步受损。因此，最大的治疗获益将源于细胞外蛋白稳态增强与溶酶体功能强化的联合策略。来自多种模式生物的证据共同表明，衰老过程中增强细胞外蛋白稳态具有广泛的机体获益，包括改善应激抵抗力、减轻炎症衰老及延长寿命。