多组学分析揭示CTHRC1+ 癌症相关成纤维细胞驱动免疫抑制微环境并预测胃癌免疫治疗耐药

《HUMAN MUTATION》：Multiomics Analysis Reveals CTHRC1+ CAFs Drive Immunosuppressive Niches and Predict Immunotherapy Resistance in Gastric Cancer

　　

癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）调控免疫排除型肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME），但在胃癌（gastric cancer, GC）中CAF异质性仍未被完全阐明。研究人员整合多队列单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）、空间转录组学和批量转录组数据，构建了GC TME的综合图谱。无监督聚类鉴定出八个转录上不同的CAF亚群，其中CTHRC1+ CAFs在肿瘤中选择性富集，并与T细胞排除表现出最强关联。伪时间轨迹分析、基因调控网络推断和细胞-细胞通讯分析显示，基本螺旋-环-螺旋转录因子家族成员e41（basic helix-loop-helix family member e41, BHLHE41）是驱动CTHRC1+ CAF分化的关键转录因子，而空间分析表明这些成纤维细胞通过巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor, MIF）介导的信号传导在肿瘤-基质界面贡献纤维化微环境。最后，研究人员开发并验证了一个CTHRC1+ 癌症相关成纤维细胞相关风险特征（CTHRC1+ cancer-associated fibroblast–related risk signature, CRS），该特征在独立队列中能准确预测免疫治疗反应。这些发现确立了CTHRC1+ CAFs作为GC中免疫排除的关键基质决定因素，表明靶向CTHRC1+ CAF-MIF轴或应用CRS指导的患者分层可能增强免疫治疗疗效。

研究背景方面，胃癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一，晚期患者治疗选择有限。免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade, ICB）虽成为有前景的策略，但其临床疗效受原发和获得性耐药显著阻碍，尤其在表现为免疫排除表型的肿瘤中。肿瘤微环境在塑造免疫反应中起关键作用，癌症相关成纤维细胞作为关键的基质架构师，建立物理和化学屏障阻止细胞毒性T细胞浸润。CAFs具有显著异质性，包括肌成纤维细胞样CAFs（myCAFs）、炎症型CAFs（iCAFs）、抗原呈递型CAFs（apCAFs）和血管型CAFs（vCAFs）等功能性不同亚型。近期scRNA-seq研究揭示特定CAF亚群通过细胞外基质（extracellular matrix, ECM）重塑和免疫抑制信号促进免疫排除，但GC中CAF异质性的全面图谱及其免疫调节功能的精确分子机制仍未完全明确。此外，CAFs与免疫细胞尤其是巨噬细胞的广泛串扰建立了自我强化的反馈环路放大基质纤维化和免疫逃逸，但GC中这些基质-免疫微环境的特定配体-受体相互作用和空间组织定义不清，且缺乏识别可从基质靶向治疗中获益患者的稳健生物标志物限制临床转化。为此，研究人员整合多队列scRNA-seq、空间转录组学和批量转录组分析构建GC TME综合图谱，旨在阐明CTHRC1+ CAFs在免疫排除中的作用机制并开发预测免疫治疗反应的生物标志物，该研究发表在《HUMAN MUTATION》。

为开展研究，研究人员使用的主要关键技术方法与样本队列来源包括：获取四个公开GC scRNA-seq数据集（GSE163558、GSE167297、GSE183904、GSE184198）共56个样本198199个细胞，四个GC空间转录组切片（GSM7990473-0476），批量RNA-seq验证队列TCGA-STAD（The Cancer Genome Atlas Stomach Adenocarcinoma），以及两个免疫治疗队列PRJEB23709和GSE91061；采用Seurat进行单细胞数据处理与质控，Harmony算法校正批次效应，基于经典标记注释细胞类型并高分辨率重聚类鉴定CAF亚型；使用AUCell进行功能注释，PROGENy和KEGG推断通路活性；Monocle 2重建伪时间轨迹，pySCENIC推断转录因子调节子；hdWGCNA识别转录模块；CellChat和NicheNet预测细胞-细胞通讯与配体-靶标互作；Seurat与RCTD（Robust Cell Type Decomposition）进行空间转录组分析与细胞反卷积；基于hdWGCNA模块基因与CTHRC1+ CAF标记基因重叠构建CRS，用ssGSEA计算风险评分并以中位值分组，在独立免疫治疗队列用ROC曲线、Kaplan-Meier生存分析和响应率比较评估预测性能；ESTIMATE计算微环境评分，CIBERSORT推断免疫细胞比例，分析肿瘤突变负荷（tumor mutational burden, TMB）、Immunophenoscore（IPS）及GISTIC2.0拷贝数变异；oncoPredict计算药物IC₅₀并进行敏感性分析；所有统计用R完成，连续变量用Wilcoxon秩和或Student t检验，分类变量用卡方或Fisher精确检验，生存用Kaplan-Meier与log-rank检验，相关性用Pearson或Spearman系数，多重检验用Benjamini-Hochberg校正，p < 0.05为显著。

研究结果部分，各小节结论如下：

3.1. Dissecting the TME and Heterogeneity of CAFs in the GC：研究人员整合四个STAD scRNA-seq数据集共198199个细胞，注释为九大主要细胞类型后对成纤维细胞重聚类，鉴定出八个转录不同的CAF亚群（APOC1+ CAF、C7+ CAF、CTHRC1+ CAF、GADD45B+ CAF、LUM+ CAF、MIF+ CAF、NEAT1+ CAF、POSTN+ CAF）。Ro/e评分显示CTHRC1+ CAF、POSTN+ CAF、MIF+ CAF在肿瘤组织中显著富集，其中CTHRC1+ CAF肿瘤相关分布最高且具有显著myCAF特征，高表达胶原基因（COL1A1、COL1A2、COL3A1）和基质金属蛋白酶（MMP11、MMP14），激活ECM受体相互作用、焦粘着斑、PI3K、MAPK、TGF-β及缺氧通路。TCGA-STAD队列验证确认CTHRC1+ CAF在胃肿瘤中丰度显著升高，因其癌组织中升高最显著而被选作进一步研究对象。

3.2. Pseudotemporal Analysis Reveals Developmental Trajectories and Regulatory Networks of CAF Subtypes in GC：Monocle 2伪时间分析揭示从LUM+ CAF起源分叉向CTHRC1+ CAF/POSTN+ CAF和MIF+ CAF终末状态的轨迹，LUM+ CAF占早期状态，myCAF样亚型富集于终末状态。BEAM识别四个基因簇，晚期限簇包含ECM重塑因子（POSTN、MMP11）和缺氧响应基因（VEGFA、SLC2A1）。pySCENIC调节子特异性评分显示BHLHE41是CTHRC1+ CAFs中最特异激活的转录因子，其mRNA表达和调节子活性均在此亚型中排他性富集，提示BHLHE41是驱动CTHRC1+ CAF分化为myCAF和促瘤表型的主调节器。

3.3. CTHRC1+ CAFs Are Associated With T Cell Exclusion in GC：在五个独立批量RNA-seq队列（TCGA-STAD、GSE84437、GSE84433、GSE26253、GSE15459）中，CTHRC1+ CAF特征评分在无响应者中显著升高，预测免疫治疗结局差。Pearson相关分析显示CTHRC1+ CAF与T细胞排除评分正相关最强（R = 0.58–0.63）。空间转录组RCTD反卷积显示CTHRC1+ CAFs富集于肿瘤-基质界面，与恶性细胞空间共定位正相关，与T/NK细胞负相关；高CTHRC1+ CAF浸润样本T/NK细胞排除更明显。细胞-细胞互作网络显示CTHRC1+ CAFs为中心节点，与恶性细胞强连接并对T/NK细胞有抑制边。通路依赖分析关联ECM重塑、TGF-β信号和免疫检查点分子表达增强。TCGA-STAD中CTHRC1+ CAF-high肿瘤高表达CD274（PD-L1）、PDCD1（PD-1）、LAG3、TIGIT、HAVCR2（TIM-3）等抑制受体。GSVA显示CTHRC1+ CAFs激活上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）、TGF-β、缺氧和糖酵解通路。

3.4. hdWGCNA Reveals Transcriptional Modules Associated With Distinct CAF Subpopulations：GSEA显示CTHRC1+ CAFs富集EMT、糖酵解、整合素信号、焦粘着斑、ECM受体相互作用和TGF-β信号（NES > 1.5，FDR < 0.05）。hdWGCNA以软阈值power = 12构建无标度网络，识别12个共表达模块（M1–M12）。M1、M2、M5、M10在CTHRC1+ CAFs中优先激活，分别对应细胞周期与增殖、ECM组织与胶原纤维组装、TGF-β信号与myCAF分化、缺氧响应与血管生成。模块特征基因评分在CTHRC1+ CAFs中显著高于其他亚型（p < 0.001），确立这些转录程序为CTHRC1+ CAF特异性特征。

3.5. CTHRC1+ CAFs May Inhibit T Cells Activity Through MIF Signaling Pathway：CellChat分析显示肿瘤中CTHRC1+ CAFs与其他细胞互作数量和强度增强，为主要信号发送者。肿瘤vs正常组织信号通路活性中MIF、CXCL、COMPLEMENT、TGF-β显著升高。CTHRC1+ CAF特异性配体-受体对分析表明MIF信号是其与免疫细胞间最突出的通讯轴：CTHRC1+ CAFs高表达MIF配体，同源受体CD74、CXCR4、CD44主要在T/NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞表达。网络中心性分析确认CTHRC1+ CAFs为MIF信号网络主导发送者和影响者，T/NK细胞和髓系细胞为主要接收者。

3.6. CRS Can Predict Immunotherapy Response：基于hdWGNCA模块基因与CTHRC1+ CAF标记基因重叠构建CRS。在PRJEB23709队列中，无响应者CRS显著更高（p < 0.001），高CRS患者总生存更差（log-rank p < 0.0001），低CRS组响应率73.2% vs高CRS组38%。GSE91061独立队列验证一致：无响应者CRS更高，高CRS生存更差，低CRS响应率38.1% vs高CRS组7.1%。药物敏感性分析显示高CRS肿瘤对达沙替尼（dasatinib）、米托蒽醌（mitoxantrone）、LY2109761的估计IC₅₀更低，更敏感；CRS与达沙替尼、PI-103、NVP-TAE684、ML210呈显著负相关，高CRS肿瘤对anagrelide、JTE-607、idronoxil、lorlatinib、ponatinib、MK-2461差异敏感。

3.7. Comprehensive Analysis of TME, Genomic Characteristics, and Clinical Prognosis Based on CRS Stratification：TCGA-STAD中高CRS肿瘤ESTIMATE基质评分、免疫评分、ESTIMATE评分显著升高，肿瘤纯度降低。CIBERSORT显示高CRS富集M2巨噬细胞和调节性T细胞等免疫抑制群体，细胞毒性淋巴细胞减少。高CRS与晚期T分期（p = 0.00019）、更高分期（p = 0.027）、较差生存状态（p = 0.051）相关。CRS与细胞溶解活性、IFN-γ响应、T细胞炎性基因表达谱负相关，与TGF-β信号、血管生成正相关。高CRS患者TMB更低（p < 0.01）。CRS联合TMB分层中高CRS/低TMB预后最差，低CRS/高TMB最好（p < 0.0001）。IPS中高CRS肿瘤CTLA4^?/PD1^?和CTLA4⁺/PD1⁺评分更低。CNV分析高CRS富集基质相关基因扩增（如COL1A1、COL3A1）和抑癌基因缺失。CRS与MCPcounter成纤维细胞评分强正相关（R = 0.967）。ssGSEA显示高CRS富集调节性T细胞、M2巨噬细胞、髓源性抑制细胞，减少细胞毒性淋巴细胞、NK细胞、活化树突状细胞；雷达图显示APC共抑制、T细胞共抑制、副炎症增强，细胞溶解活性、I型IFN响应、T细胞共刺激减弱；免疫检查点分子CD274、PDCD1、CTLA4、LAG3、TIGIT、HAVCR2、PDCD1LG2、CD276表达升高；癌症-免疫循环多阶段受损。GISTIC2.0显示高CRS广泛染色体不稳定，1q21-23和8q24扩增，9p21和18q21缺失，焦点和臂级CNV更高。

讨论部分总结，研究人员确立CTHRC1+ CAFs为GC中免疫排除和免疫治疗耐药的关键基质决定因素。整合多组学鉴定八个CAF亚群，CTHRC1+ CAFs选择性肿瘤富集、具myCAF特征且与T细胞排除最强相关。伪时间和基因调控网络揭示从LUM+ CAF向CTHRC1+ CAF/MIF+ CAF分叉轨迹，BHLHE41为CTHRC1+ CAFs特异主调节器，关联缺氧响应和糖酵解转换及myCAF分化。空间上CTHRC1+ CAFs定位于肿瘤-基质界面形成致密微环境阻隔免疫细胞，MIF信号为其免疫抑制主要通路，CTHRC1+ CAFs高表达MIF，受体在T/NK和髓系细胞，建立旁分泌轴抑制T细胞并促进免疫抑制髓系极化。CRS在独立队列稳健预测免疫治疗反应和生存，低CRS与高CRS响应率差异显著，联合TMB细化预后，高CRS肿瘤对达沙替尼等更敏感，支持联合基质靶向与ICB的精准策略。靶向CTHRC1+ CAFs和MIF轴具转化价值，MIF抑制剂（ISO-1、4-IPP）、CXCR4拮抗剂（plerixafor）、达沙替尼可破坏该轴，现有CXCR4拮抗剂和TGF-β抑制剂在GC联合ICI试验中，但无基于CTHRC1+ CAF丰度的患者筛选，CRS填补此空白。局限在于缺乏功能验证，MIF信号需实验确认；未来拟用原代CTHRC1+ CAFs与T/NK共培养、BHLHE41敲低评估T细胞抑制，胃癌类器官共培养评估靶向药反应，免疫 competent小鼠模型体内验证CAF-MIF轴，将关联发现转为因果机制和临床前概念验证。

结论部分翻译：总之，本研究将CTHRC1+ CAFs定义为通过BHLHE41驱动分化和MIF介导免疫抑制来调控免疫排除的核心架构者。CRS生物标志物能够识别可能受益于基质靶向联合治疗的患者，为克服GC免疫治疗耐药提供有前景的策略。

要不要我帮你把这篇解读里提到的CTHRC1+、BHLHE41、MIF等关键分子的具体作用机制再单独梳理成一条精简的时间线或逻辑链？