小鼠和猴中央杏仁核中含降钙素基因相关肽（CGRP）的末梢：超微结构分析和GluD1的突触下表达

《European Journal of Neuroscience》：Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP)-Containing Terminals in the Central Amygdala of Mice and Monkeys: Ultrastructural Analysis and Subsynaptic Expression of GluD1

　　

右侧中央杏仁核（CeA）参与疼痛情感-情绪维度的处理。通过脊髓-臂旁-杏仁核疼痛通路，CeA从臂旁核中的降钙素基因相关肽（CGRP）神经元接收伤害性信息。近期证据表明，谷氨酸delta 1受体（GluD1），一种非典型离子型谷氨酸受体，主要作为突触形成分子参与突触的形成和维持，调控小鼠中的这一投射。尽管其细胞表达强烈，但关于GluD1在CeA神经元中的突触下定位及其与CGRP末梢的潜在相互作用所知甚少。为解决这一问题并进一步表征CGRP末梢在物种间的超微结构和突触连接性，研究人员在小鼠和猴中使用了单标记和双标记免疫电子显微镜技术。对于所有检测的超微结构参数，未发现物种差异。在两个物种中，CGRP阳性（CGRP⁺）末梢与树突形成对称或不对称突触，与胞体形成对称突触，较少与棘形成不对称突触。近90%形成不对称或对称突触的CGRP⁺末梢表达vGluT2免疫反应性，证实了该投射的谷氨酸能和肽能性质。共聚焦显微镜分析确认了小鼠和猴中CGRP⁺与GluD1⁺ puncta的胞体周围关联。在超微结构水平，GluD1在对称轴-树突和轴-胞体突触的核心以及由CGRP⁺末梢形成的不对称突触的突触周围表达。这些发现表明，CGRP⁺ PB-CeA投射通过一个异质性末梢群体介导其效应，该群体在啮齿类和灵长类中与GluD1表现出强烈的突触关系。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**

疼痛是一种复杂的多维体验，涉及感觉运动、认知和情感-情绪方面。中枢杏仁核（CeA），特别是其外侧和囊状部，被认为是处理疼痛情感-情绪成分的关键脑区，被称为“伤害性杏仁核”。CeA通过脊髓-臂旁-杏仁核疼痛通路接收来自臂旁核（PB）的谷氨酸能投射，其中降钙素基因相关肽（CGRP）是PB至CeA投射的唯一肽能标志物。CGRP阳性末梢主要靶向蛋白激酶Cδ（PKCδ⁺）神经元，后者被认为是“促伤害性”的，因为其激活增加疼痛相关反应。然而，关于PB-CeA突触的结构性突触信号传递仍存在显著知识空白。近期研究表明，谷氨酸delta 1受体（GluD1），一种非典型离子型谷氨酸受体，主要作为突触形成分子，调节PB-CeA突触的兴奋性传递，并参与炎症性和神经病理性疼痛模型。尽管GluD1在CeA中有强细胞表达，但其亚细胞定位、与CGRP末梢的突触下关系以及跨物种保守性尚不清楚。因此，研究人员开展了本研究，旨在通过免疫电子显微镜技术（EM）详细表征小鼠和猴CeA中CGRP末梢的超微结构、突触组织及递质内容，并阐明GluD1与CGRP末梢的突触下关系，以增强向人类转化的基础。

**研究内容与结论**

研究人员使用单标记和双标记免疫电子显微镜技术，在小鼠（C57Bl/6J，共8只）和恒河猴（Macaca mulatta，共7只）的右侧CeA中，分析了CGRP末梢的超微结构特征、突触连接性、vGluT2共表达以及GluD1的突触下定位。研究得出以下主要结论：1）CGRP⁺末梢的超微结构和突触连接模式在小鼠和猴中高度保守，无显著物种差异；2）CGRP⁺末梢形成异质性突触，包括与树突的对称和不对称突触、与胞体的对称突触以及与棘的不对称突触；3）大多数CGRP⁺末梢（约67-70%）共表达vGluT2，证实其谷氨酸能性质，但约10-20%的形成对称突触的末梢缺乏vGluT2，提示可能存在纯肽能性末梢亚群；4）GluD1在CGRP⁺末梢形成的突触中表达，其中对称突触的核心富含GluD1，而不对称突触中GluD1呈突触周围定位。这些发现表明，CGRP⁺ PB-CeA投射通过一个异质性末梢群体发挥效应，该群体与GluD1在不同物种中均表现出强烈的突触关系，为理解疼痛信号传递的解剖基础提供了新见解。

**重要意义**

论文发表在《European Journal of Neuroscience》。该研究首次提供了灵长类CeA中CGRP⁺ PB-CeA末梢的超微结构和突触组织的详细分析，并通过严格的种间比较证实了啮齿类和灵长类之间该突触网络的高度可比性，增加了向人类转化的价值。此外，研究揭示了GluD1在CGRP⁺突触中的差异定位模式，为未来功能实验探索GluD1在疼痛信号传递和突触可塑性中的作用奠定了基础。

**主要技术方法（不超过250字）**

研究人员使用单标记免疫过氧化物酶和双标记免疫过氧化物酶-免疫金电子显微镜技术，对小鼠（C57Bl/6J，8只，来自Dravid实验室及Emory国家灵长类研究中心）和恒河猴（Macaca mulatta，7只，来自Emory国家灵长类研究中心）的右侧CeA组织进行分析。主要方法包括：1）CGRP免疫过氧化物酶定位以观察超微结构；2）CGRP与vGluT2双标记以评估谷氨酸能递质性质；3）CGRP与GluD1双标记以确定突触下定位。所有组织均取自右侧半球，以对应疼痛偏侧化证据。超薄切片（60 nm）在透射电子显微镜下观察，统计分析了突触类型、靶标分布及金颗粒定位。

**研究结果**

**3.1 光镜和共聚焦显微镜数据** 通过免疫过氧化物酶染色和双免疫荧光共聚焦显微镜，研究人员发现小鼠和猴CeA中CGRP和GluD1的神经毡标记高度重叠，并观察到CGRP⁺/GluD1⁺ puncta围绕神经元胞体形成密集的胞体周围篮状结构，确认了两种分子在CeA中的密切关联，且该现象在灵长类中保守。

**3.2 CeA中CGRP⁺末梢的超微结构特征** 通过透射电子显微镜分析，研究人员发现CGRP⁺末梢大小不一（0.25~1 μm），含有小清亮囊泡和大致密核心囊泡（DCVs）。这些末梢主要形成轴-树突突触（小鼠56.6%，猴70.1%），其次为轴-棘突触和轴-胞体突触，且这些分布模式在物种间无显著差异。

**3.2.1 CGRP⁺末梢的突触后靶标** 定量分析显示，CGRP⁺末梢的突触后靶标分布在小鼠和猴中相似：轴-树突突触最多，轴-棘和轴-胞体突触较少，且无显著物种差异（未配对t检验，p>0.05）。

**3.2.2 CGRP⁺末梢形成对称或不对称突触** 突触类型分析发现，CGRP⁺末梢形成的对称和不对称突触比例大致相等（小鼠55%对称，猴50.9%对称），但随靶标不同而变化：轴-棘突触主要为不对称（约75-79%），轴-胞体突触主要为对称（约79-86%），轴-树突突触则均匀分布。这些模式在物种间保守。

**3.2.3 CGRP⁺末梢主要表达vGluT2** 双标记免疫电镜显示，小鼠66.7%和猴69.5%的CGRP⁺末梢共表达vGluT2，且在不形成对称突触的末梢中，约88.9%（小鼠）和79.0%（猴）的CGRP⁺末梢也表达vGluT2，证实大多数CGRP⁺末梢为谷氨酸能。然而，约10-20%的形成对称突触的CGRP⁺末梢缺乏vGluT2，提示存在纯肽能性末梢亚群。

**3.3 GluD1在CGRP⁺末梢形成的突触中的表达** 双标记CGRP（免疫过氧化物酶）和GluD1（免疫金）实验显示，42.5%（小鼠）和51.6%（猴）的CGRP⁺突触表达GluD1，无显著物种差异。GluD1金颗粒主要位于对称轴-树突和轴-胞体突触的核心，以及不对称轴-树突和轴-棘突触的突触周围边缘。进一步分析显示，最常见的GluD1⁺突触类型为对称突触（核心标记），其次为不对称突触（周围标记），且该分布模式在胞体、树突和棘上均一致。

**总结讨论与翻译研究结论**

讨论部分总结：研究人员指出，CGRP⁺末梢在CeA中呈现异质性，形成对称或不对称突触，且大多数表达vGluT2，确认了谷氨酸能性质。对称突触中GluD1的核心定位与不对称突触中的周围定位差异，提示不同突触类型可能具有不同的信号传递机制和蛋白质组成。此外，CGRP⁺/vGluT2^-末梢可能通过CGRP肽能传递介导部分疼痛可塑性。GluD1与CGRP⁺突触的强关联支持其在疼痛信号调节中的作用。更重要的是，所有超微结构参数在啮齿类和灵长类中高度保守，增强了该研究的转化价值。

研究结论（Concluding Remarks）翻译：PB-CeA突触的传递和可塑性已在啮齿类中得到充分研究。本研究通过加深对小鼠和猴中这些突触传递伤害性信号的解剖基础的理解，进一步扩展了这一知识。本研究首次提供了灵长类CeA中CGRP⁺ PB-CeA末梢的超微结构特征和突触组织的详细分析。本研究中收集的超微结构数据的严格物种比较使我们能够得出结论：介导PB-CeA突触传递伤害性信号的潜在突触网络在灵长类和啮齿类之间高度可比，增加了我们的发现向人类大脑的转化价值。本工作的另一个重要贡献是提供了进一步证据，表明CeA中的CGRP⁺末梢是异质性的，并形成对称或不对称突触。尽管之前已有报道，但这两种突触类型之间结构差异的潜在功能意义尚未得到足够关注。即使我们的发现未提供证据表明通过这些结构不同的突触进行信号传递具有特定特性，它们为未来旨在比较对称与不对称PB-CeA突触特性的功能实验奠定了基础。我们的数据表明，两种类型的末梢均表达vGluT2，从而确认了PB-CeA投射的谷氨酸能性质。最后，我们的双标记免疫电子显微镜实验证明，在小鼠和猴的CeA中，CGRP⁺末梢形成的对称突触核心和不对称突触边缘存在强GluD1突触后表达，扩展了近期关于GluD1调节CGRP⁺ PB-CeA突触的证据。总之，这些发现扩展了关于介导通过臂旁-杏仁核通路传递伤害性信号的解剖基础的知识，并为未来机制实验奠定了基础，以进一步阐明GluD1如何在对照状态和响应上行伤害性信号时参与该突触网络的发育、调节和维持。