《JOURNAL OF FOOD PROCESSING AND PRESERVATION》：Identification of Antibacterial Compounds From Yeast-Fermented Green Tea Leaf Extract via Bioautography and GC–MS
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绿茶多酚表现出包括抗菌效应在内的一系列生物活性，其可通过微生物发酵进一步增强。为探究此增强效应，本研究检测了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵绿茶叶所提提取物的抗菌活性并鉴定其主要活性化合物。绿茶叶粉末与S. cerevisiae
绿茶多酚表现出包括抗菌效应在内的一系列生物活性，其可通过微生物发酵进一步增强。为探究此增强效应，本研究检测了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵绿茶叶所提提取物的抗菌活性并鉴定其主要活性化合物。绿茶叶粉末与S. cerevisiae KFRI 122在无添加剂的去离子水中于35°C发酵5天。基于最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)与最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration, MBC)值的测定，比较了酵母发酵提取物与非发酵乙醇提取物对九种食源性致病菌的抗菌活性。酵母发酵增加了总酚与总黄酮含量，并相较于热处理（非发酵）提取物改善了抗菌活性，尤其针对地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)与副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)。活性抗菌组分经基于薄层色谱(thin layer chromatography, TLC)的生物自显影确认并随后通过气相色谱-质谱法(gas chromatography–mass spectrometry, GC–MS)分析。咖啡因、儿茶素(catechin)、没食子酸、表没食子儿茶素(epigallocatechin)与表儿茶素(epicatechin)在乙醇提取物与发酵提取物的活性抗菌组分中均被鉴定出来。GC–MS分析显示酵母发酵改变了提取物的组成，表现为糖类含量降低与酚类化合物相对比例增加。值得注意的是，两提取物的活性组分对V. parahaemolyticus的抑制活性均强于葡萄柚籽提取物(grapefruit seed extract)。这些发现表明酵母发酵是提升绿茶提取物抗菌潜力的有效策略，并支持天然抗菌剂的开发。
研究背景与意义
食品保鲜在保障安全、延长货架期及维持储运品质方面至关重要，然而微生物生长仍是导致食品腐败、经济损失与健康风险的主因。为此，多种合成防腐剂广泛应用于食品工业，但其潜在的致敏与致癌效应引发消费者对含合成添加剂食品的抵触，促使开发天然替代品成为关注焦点。目前韩国食品添加剂法典仅正式批准ε-聚赖氨酸、乳酸链球菌肽(nisin)与葡萄柚籽提取物三种天然防腐剂，适用范围有限的天然防腐剂仍需持续探索。绿茶(Camellia sinensis)富含多酚（约占干重36%），如儿茶素等酚类化合物，具备抗菌、抗炎与抗氧化等生物活性。植物细胞中植物化学物常以糖苷形式结合糖分，受多糖结构复杂性影响难以提取。近期研究利用产水解酶微生物分解复杂结合物并通过生物转化增强植物化学物生物活性，酿酒酵母(S. cerevisiae)发酵已被报道可提升植物提取物酚含量并产生新衍生物。抗菌化合物鉴定对工业应用至关重要，传统生物活性导向分离耗时费力，而基于薄层色谱(TLC)的生物自显影可快速定位与初步分离未知抗菌化合物。尽管酚类化合物通常分子量低、极性强且非挥发性，衍生化可改善其挥发性与热稳定性以进行气相色谱-质谱法(GC–MS)分析。研究人员前期研究发现S. cerevisiae发酵绿茶叶可增强提取物抗氧化与抗菌活性，但发酵引起的组成变化及负责抗菌效应的活性化合物精确鉴定尚不清楚。因此，本研究旨在通过TLC生物自显影与GC–MS分析阐明酵母发酵绿茶提取物对食源性致病菌的抗菌潜力并鉴定主要抗菌化合物，为天然防腐剂开发与质量控制提供科学依据。该研究发表于《JOURNAL OF FOOD PROCESSING AND PRESERVATION》。
主要关键技术方法
研究人员使用采自韩国河东的绿茶叶粉末，以S. cerevisiae KFRI 122（自传统马格利酒分离保藏）进行发酵，并以热处理50%乙醇提取物为对照；选用九种食源性致病菌（四株革兰氏阳性菌与五株革兰氏阴性菌，源自韩国典型培养物保藏中心KCTC与韩国病原体国家培养物保藏中心NCCP）；通过Folin–Denis法与铝氯化物法分别测定总酚含量(total phenolic content, TPC)与总黄酮含量(total flavonoid content, TFC)；采用肉汤微量稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)与最小杀菌浓度(MBC)；利用TLC生物自显影筛选抗菌化合物并以甲硅烷基化衍生化后进行GC–MS分析鉴定组分；对TLC刮取活性组分及标准品单体进行MIC与MBC验证；数据统计采用SPSS进行单因素方差分析与Tukey多重比较。
研究结果
3.1. Yield, TPC, and TFC
提取得率在27.10%至28.13%间无显著差异(p > 0.05)。TPC受提取条件影响显著，50%乙醇提取物(EOH)高于水提取物(DW)，额外加热(EOH-H)无显著影响，酵母发酵提取物(Yeast-F)TPC最高(p < 0.05)；TFC总体相近，Yeast-F与EOH显著高于其余组，EOH-H显著低于EOH(p < 0.05)。据此研究人员后续比较EOH-H与Yeast-F以评估酵母发酵影响。
3.2. Antibacterial Activities of EOH-H and Yeast-F
溶剂对照无抑菌活性，葡萄柚籽提取物(grapefruit seed extract, GSE)、EOH-H与Yeast-F对所有测试菌均有生长抑制与杀菌效应，具广谱抗菌性；GSE活性普遍高于二者。EOH-H与Yeast-F的MIC与MBC范围分别为1.25至5.00 mg/mL与2.50至10.00 mg/mL，地衣芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌与副溶血性弧菌更敏感；多数菌MBC/MIC ≤ 4具杀菌性。Yeast-F对地衣芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌与副溶血性弧菌的MIC更低，对金黄色葡萄球菌MBC亦降低，表明酵母发酵提升了热处理提取物抗菌活性。
3.3. Bioautography for the Screening of Antibacterial Compounds
基于TLC生物自显影以金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性）与副溶血性弧菌（革兰氏阴性）筛选主要抗菌化合物；抑制区（黄色）滞后因子(retardation factor, Rf)因菌株略异，主要抗菌化合物可能不同。基于金黄色葡萄球菌抑制区定义组分1(Fraction 1, F1, Rf 0.82–0.97)，其与副溶血性弧菌抑制区大部分重叠，F1经检测试剂确认为酚类化合物；硫酸染色依有机物图谱划分组分2(F2, Rf 0.71–0.81)与组分3(F3, Rf 0.60–0.70)；Yeast-F中F3斑点显著减少，归因于发酵期间糖降解，糖化合物减少可能促成酚类化合物相对富集。
3.4. Identification of the Antibacterial Compounds by GC–MS Analysis
EOH-H检出22种化合物（糖类11、有机酸6、酚类4、生物碱1），总有机物含量621.0 mg/g；Yeast-F总有机物233.2 mg/g，糖类从386.3 mg/g降至9.5 mg/g，源于发酵糖利用。EOH-H组成依次为糖类(62.2%)、有机酸(20.6%)、酚类(14.8%)；Yeast-F为有机酸(48.9%)、酚类(41.2%)、生物碱(5.9%)，酚类比例上升部分因糖类消耗相对富集，可能与抗菌活性增强有关。Yeast-F独有微量莽草酸（经莽草酸途径生物合成），但未在活性F1检出，无法直接确认其抗菌贡献。生物自显影显示EOH-H与Yeast-F抗菌活性集中于F1(Rf 0.82–0.97)，GC–MS鉴定F1主要成分为咖啡因、没食子酸、儿茶素、表儿茶素与表没食子儿茶素；F2与F3主要由糖类与有机酸组成，酵母发酵显著减少这些组分并消除大部分F3斑点。
3.5. Antibacterial Activities of Active Fractions and Their Major Compounds
仅EOH-H与Yeast-F的F1有抗菌活性，F2与F3无抑制，与生物自显影一致。EOH-H-F1与Yeast-F-F1对副溶血性弧菌MIC分别为0.63 mg/mL与0.31 mg/mL，强于各自粗提物(EOH-H: 1.25 mg/mL；Yeast-F: 0.63 mg/mL)与GSE(1.25 mg/mL)；对金黄色葡萄球菌F1较粗提物无明显改善且弱于GSE。GC–MS鉴定F1主要化合物为没食子酸、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素；其中表没食子儿茶素抗菌最强，对金黄色葡萄球菌与副溶血性弧菌MIC分别为0.04 mg/mL与0.08 mg/mL；没食子酸次之(0.31 mg/mL)；儿茶素与表儿茶素中等；咖啡因较弱。据MBC/MIC≤4杀菌阈值，表没食子儿茶素对副溶血性弧菌具杀菌性(MBC/MIC=2.0)，对金黄色葡萄球菌呈抑菌性(MBC/MIC=31.25)，作用机制可能因靶细菌而异但未探讨。基于效价与定量，表没食子儿茶素与没食子酸为主要贡献者，儿茶素与表儿茶素影响较小；表没食子儿茶素对两菌均强于GSE。
讨论总结与研究结论翻译
讨论部分指出，尽管EOH-H与Yeast-F提取得率无显著差异，GC–MS可检测化合物总量下降而TPC上升；文献报道儿茶素加工中可与醛缩合聚合形成更复杂多酚，故部分提取物质量未被GC–MS检出，发酵组成变化可能未完全反映于GC–MS谱图。F1为酚类富集活性区，咖啡因与主要儿茶素相关化合物经GC–MS鉴定；活性组分与单体MIC/MBC验证表明表没食子儿茶素与没食子酸虽非最丰富组分却是主要活性贡献者。这些发现共同支持酵母发酵是提升热处理绿茶提取物抗菌性质的有效途径，需进一步在复杂食品基质中评估其对金黄色葡萄球菌与副溶血性弧菌的抗菌效率并验证实际加工储运条件下有效性。
研究结论部分翻译如下：
本研究采用涵盖提取物制备、活性导向分离、化合物鉴定与单体抗菌活性评估的连续分析方法，探究酵母发酵如何增强绿茶叶提取物的抗菌活性。酿酒酵母(S. cerevisiae) KFRI 122发酵引起提取物显著组成变化，包括可提取酚类化合物增加与糖类减少，而不影响整体提取得率。与EOH-H相比，Yeast-F表现出增强的抗菌活性，尤其针对地衣芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌与副溶血性弧菌。基于TLC的生物自显影抗菌筛选确认活性集中于酚类富集组分(F1)，经GC–MS从该组分鉴定出咖啡因与主要儿茶素相关化合物。活性组分与单体化合物的抗菌效应经MIC与MBC测定验证，表明表没食子儿茶素与没食子酸是观察到活性的主要贡献者，尽管它们并非含量最丰富的组分。这些发现共同支持酵母发酵作为改善热处理绿茶提取物抗菌性质的有效方法。需进一步研究评估其在复杂食品基质中对金黄色葡萄球菌与副溶血性弧菌的抗菌效率，并在实际食品加工与储存条件下验证其有效性。
