《The FASEB Journal》：Ubiquitination-Related Diagnostic Biomarkers for Diabetic Nephropathy: Insights From Multiomic Analysis, Drug Docking, and Experimental Validation
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本研究旨在鉴定糖尿病肾病（DN）中的泛素化相关诊断生物标志物，探索其分子机制和候选治疗药物，并通过体内和体外实验进一步验证其表达和功能。使用来自GEO数据库的GSE30122数据集筛选差异表达基因（DEGs）。泛素化相关基因（URGs）来源于GSEA数据库。应
本研究旨在鉴定糖尿病肾病（DN）中的泛素化相关诊断生物标志物，探索其分子机制和候选治疗药物，并通过体内和体外实验进一步验证其表达和功能。使用来自GEO数据库的GSE30122数据集筛选差异表达基因（DEGs）。泛素化相关基因（URGs）来源于GSEA数据库。应用加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定泛素化相关基因模块。采用最小绝对收缩和选择算子（LASSO）逻辑回归和支持向量机递归特征消除（SVM-RFE）算法筛选DN中的泛素化相关诊断生物标志物。建立了列线图诊断模型。应用ssGSEA分析这些生物标志物与免疫细胞类型和免疫过程的关系。使用共识聚类分析识别不同的泛素化相关DN亚型。利用单细胞数据集GSE195460探索诊断生物标志物的细胞分布。进行了药物预测和分子对接以确定有前景的治疗药物。进行了体内（小鼠和人DN组织）和体外（NLK过表达的足细胞）验证。鉴定出五个泛素化相关诊断生物标志物（TRIM22、RCN1、ZNF204P、LPGAT1和NLK），列线图模型显示出良好的诊断效率。免疫相关分析显示，这些诊断生物标志物与免疫细胞和免疫过程显著相关。DN样本被聚类为三个泛素化相关亚型，其中高表达亚型表现出较低的免疫浸润。分子对接结果表明，槲皮素与TRIM22、LPGAT1和NLK具有有利的结合能，白藜芦醇与RCN1具有良好的结合能。体内验证表明，在人和小鼠DN的肾组织中，TRIM22、RCN1和LPGAT1表达上调，而NLK表达下调。体外实验证实，NLK过表达通过增加足细胞标志物（podocin和WT1）和Bcl-2（一种抗凋亡蛋白）的表达，同时减少Bax和caspase-1（促凋亡蛋白）的表达，改善了高糖诱导的足细胞损伤和凋亡。TRIM22、RCN1、ZNF204P、LPGAT1和NLK是DN的潜在诊断生物标志物，构建的列线图模型具有良好的诊断性能。诊断生物标志物与免疫细胞和免疫过程密切相关。槲皮素和白藜芦醇是针对这些生物标志物的潜在治疗药物。NLK可能通过减轻足细胞损伤和凋亡在DN中发挥保护作用。
**论文解读文章**
**研究背景与目的**
糖尿病肾病（DN）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，影响全球超过1.5亿人，是终末期肾病的主要病因，并显著增加心血管疾病风险。其发病机制复杂，涉及代谢紊乱、氧化应激、炎症反应及肾脏固有细胞损伤。然而，早期诊断和疾病监测仍面临挑战，传统标志物如尿微量白蛋白敏感性有限，许多患者确诊时已处于中晚期。因此，识别高特异性和敏感性的早期诊断生物标志物对改善DN预后至关重要。近年来，泛素化作为一种关键翻译后修饰，在肾脏疾病中的作用受到关注。泛素化调控蛋白质降解、定位和功能，参与凋亡、炎症和细胞增殖等过程，其失调与DN的肾小球硬化和肾小管间质纤维化等核心病理特征密切相关。本研究旨在通过多组学分析、药物对接和实验验证，筛选DN中的泛素化相关诊断生物标志物，探索其分子机制和候选治疗药物，并为早期诊断和个性化治疗提供新见解。该论文发表在《The FASEB Journal》。
**主要技术方法**
研究人员利用公共数据库GEO中的转录组数据集GSE30122（包含19例DN肾组织样本和50例正常肾组织样本）和单细胞数据集GSE195460（包含2例DN肾组织样本和1例正常肾组织样本），以及从GSEA数据库获取的泛素化相关基因集。通过差异表达基因（DEGs）筛选、加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定泛素化相关模块，并联合LASSO逻辑回归和SVM-RFE算法筛选诊断生物标志物。随后构建列线图诊断模型，进行ssGSEA免疫分析、共识聚类识别亚型、单细胞分析探索细胞分布，并通过CTD数据库预测药物及AutoDock软件进行分子对接。最后，在体内（小鼠模型和人DN肾组织）和体外（NLK过表达足细胞）进行验证。
**研究结果**
**3.1 差异表达基因（DEGs）与功能注释**
通过GSE30122数据集筛选出368个DEGs（248个上调，120个下调）。KEGG分析显示这些基因富集于黏着斑、补体与凝血级联等通路；GO分析显示其与白细胞介导的免疫、免疫应答激活等生物过程显著相关。
**3.2 WGCNA与关键模块功能注释**
基于泛素化评分，通过WGCNA将基因聚类为5个模块，其中Turquoise模块（1888个基因）与泛素化相关性最强（cor=0.61，p=3e-08）。该模块基因富集于Rap1信号、内吞作用、肾脏发育等通路。
**3.3 诊断生物标志物的鉴定**
将368个DEGs与Turquoise模块的1888个基因取交集，获得98个重叠基因。通过LASSO回归和SVM-RFE算法，最终鉴定出5个泛素化相关诊断生物标志物：TRIM22、RCN1、ZNF204P、LPGAT1和NLK。
**3.4 诊断模型可视化**
在DN组中，TRIM22、RCN1和LPGAT1显著上调，ZNF204P和NLK显著下调。基于这5个标志物构建的列线图诊断模型显示出良好诊断效能，各标志物的AUC值分别为0.869、0.839、0.777、0.762和0.786。
**3.5 诊断生物标志物的功能富集分析**
GSEA显示TRIM22富集于吞噬体、泛素介导的蛋白水解等通路；RCN1富集于吞噬体、细胞周期等；ZNF204P富集于吞噬体、线粒体自噬等；LPGAT1富集于内质网蛋白加工；NLK富集于肌动蛋白细胞骨架调控。GSVA表明高表达TRIM22与未折叠蛋白反应（UPR）和P53通路相关，高表达NLK与TNFA信号和Notch信号相关。
**3.6 免疫相关性分析**
DN组中细胞溶解活性、HLA等免疫细胞/过程显著富集。各标志物与免疫细胞/过程显著相关：ZNF204P与树突状细胞（DCs）和巨噬细胞负相关；TRIM22与Tregs和MHC I类正相关；RCN1与中性粒细胞和NK细胞正相关；NLK与APC共抑制和肥大细胞负相关；LPGAT1与Tregs和NK细胞正相关。通过TISIDB数据库分析，多数标志物与免疫因子呈负相关。
**3.7 泛素化亚型的构建与特征**
共识聚类将19个DN样本分为3个亚型（簇I、II、III）。簇III中LPGAT1和ZNF204P显著上调。簇II（低泛素化相关基因表达）免疫细胞/过程丰度最高，DCs和T辅助细胞显著增多。GSVA显示簇I和II在炎症反应和同种异体移植排斥等通路中活性高，而簇III在氧化磷酸化和脂肪酸代谢等通路中活性高。
**3.8 关键基因的单细胞分析**
单细胞数据集GSE195460鉴定出7种细胞类型。RCN1主要由成纤维细胞表达，TRIM22由树突状细胞表达，LPGAT1在T细胞中高表达，NLK在足细胞中高表达。AUCell分析显示TRIM22在同种异体移植排斥和干扰素γ应答通路中活性高，NLK在TGF-β信号和蛋白分泌通路中活性高。
**3.9 靶向分子化合物预测与分子对接**
通过CTD数据库预测药物，分子对接显示槲皮素与TRIM22（-4.31 kcal/mol）、LPGAT1（-5.72 kcal/mol）和NLK（-7.14 kcal/mol）具有良好结合能；白藜芦醇与RCN1（-5.01 kcal/mol）具有良好结合能。
**3.10 在DN患者和动物模型中的验证**
免疫组化显示，DN患者肾组织中TRIM22、RCN1、LPGAT1表达升高，NLK表达降低。STZ诱导的DN小鼠模型也证实了相同的表达趋势，且模型组24小时尿白蛋白和血清肌酐水平显著升高，伴有系膜细胞增殖和基质扩张。
**3.11 NLK改善DN中足细胞损伤和凋亡**
在体外，高糖（HG）处理足细胞后NLK表达下调。NLK过表达可上调足细胞标志物podocin和WT1的表达，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，同时降低促凋亡蛋白Bax和caspase-1的表达，表明NLK过表达能够减轻高糖诱导的足细胞损伤和凋亡。
**讨论与结论**
本研究通过生物信息学分析，从GEO数据库的DN数据集中鉴定出5个泛素化相关诊断生物标志物（TRIM22、RCN1、ZNF204P、LPGAT1和NLK），并探索了它们与肾脏免疫微环境和关键信号通路的关系。药物预测提示槲皮素和白藜芦醇可能是靶向这些标志物的潜在治疗药物。体内外实验验证了这些标志物在DN肾组织中的差异表达，并发现NLK过表达可缓解足细胞损伤和凋亡。研究结论为：TRIM22、RCN1、ZNF204P、LPGAT1和NLK是DN的潜在诊断生物标志物，构建的列线图模型具有良好的诊断性能；这些标志物与免疫细胞和免疫过程密切相关；槲皮素和白藜芦醇可能是靶向这些标志物的潜在治疗药物；NLK可能通过减轻足细胞损伤和凋亡在DN中发挥保护作用。
