综述：PANoptosis与肿瘤微环境中的免疫重塑

《The FASEB Journal》：PANoptosis and Immune Remodeling in the Tumor Microenvironment

　　

近年来，PANoptosis因其促进炎症的潜力而受到越来越多的关注。然而，包括对常规治疗的耐药性和免疫逃逸在内的几个问题，与肿瘤微环境(TME)中的炎症相关。新发现的程序性细胞死亡(PCD)方式PANoptosis受NLRP12-、ZBP1-、AIM2-和RIPK1-PANoptosome组装的控制，同时表现出细胞凋亡、程序性坏死和细胞焦亡的特征。本综述总结了微环境内PANoptosis的多方面特征及决定其敏感性的分子机制。研究人员探讨了PANoptosis在肿瘤微环境(TME)中的免疫调节功能，包括免疫细胞如何介导肿瘤细胞发生PANoptosis，以及肿瘤细胞如何利用PANoptosis来逃避免疫反应并促进免疫抑制。PANoptosis在免疫重塑中的关键作用提示了肿瘤的 promising therapeutic strategies (有前景的治疗策略)，如免疫治疗和联合治疗。PANoptosis的诱导可能建立一个促进免疫激活的正反馈环路，并有潜力重塑免疫抑制性的肿瘤微环境(TME)。未来的策略有望为更精确、个性化的癌症治疗提供新方向。

1 引言
对于调节稳态、发育和组织重塑的生物体而言，细胞死亡是一个基本过程。由专门分子机制介导的程序性细胞死亡(PCD)包括细胞凋亡、程序性坏死和细胞焦亡。活性氧(ROS)产生、DNA损伤、死亡受体-配体结合、病毒感染或钙离子失调等条件均可引起细胞凋亡。CASP家族被激活，引发导致膜起泡和核固缩的级联反应。程序性坏死受微生物核酸或死亡受体与配体相互作用的调节，主要依赖于激活的受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)和RIPK3，它们形成坏死体并导致混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)寡聚化，引起细胞膜破裂。生物标志物如TREM1介导的细胞焦亡被用于评估治疗疗效和不良反应。被称为PANoptosis的整合性细胞死亡程序近年来引起了广泛关注。识别病原体相关分子模式或损伤相关分子模式(DAMPs)的细胞内感应器，如黑色素瘤缺失蛋白2(AIM2)和Z-DNA结合蛋白1(ZBP1)，触发PANoptosome组装。这种多蛋白复合物通过激活CASP 3/7、裂解Gasdermin D(GSDMD)和磷酸化MLKL，同时驱动程序性坏死、细胞凋亡和细胞焦亡的关键因子。作为一种汇聚性细胞死亡机制，PANoptosis在肿瘤微环境(TME)中触发细胞毒性。因此，诱导PANoptosis也被认为是减轻肿瘤负荷和克服治疗耐药性的前瞻性方法。虽然常规手段已得到广泛应用，但将免疫疗法与其他治疗相结合在恶性肿瘤管理中产生了令人鼓舞的结果。免疫反应的激发是这些策略的核心机制。然而，免疫疗法在实体瘤中仍面临两个重大挑战：免疫逃逸和耐药性。针对PANoptosis机制的创新疗法可能会带来新的发现，并有助于克服现有疗法的局限性。

2 PANoptosis的分子机制
控制PANoptosis的主要机制是PANoptosome的形成。单细胞分析表明，不同的病理情况，包括细菌和病毒感染、细胞因子风暴和肿瘤改变，都能引起PANoptosome在细胞内的组装。PANoptosome的组装依赖于特定刺激，通常包含三个核心组件：具有感应结构域的感应蛋白、具有招募结构域的衔接蛋白和具有催化结构域的效应蛋白。已报道了四种不同形式的PANoptosome复合物：NLRP12-PANoptosome、ZBP1-PANoptosome、AIM2-PANoptosome和RIPK1-PANoptosome。响应血红素加病原体相关分子模式或肿瘤坏死因子-α，细胞质先天免疫感应器NLRP12触发PANoptosome激活、炎症和细胞死亡。在外源感染期间，AIM2蛋白识别PAMPs，与ZBP1形成复合物以启动PANoptosome组装。PANoptosis的顶端感应器ZBP1和RIPK1也分别与细菌和真菌感染相关。通过结构域特异性机制，衔接蛋白和催化效应因子结合形成PANoptosome，进而启动PCD过程。Fas相关死亡结构域(FADD)招募pro-CASP-8形成死亡诱导信号复合物(DISC)。pro-CASP-8发生自身裂解产生具有酶活性的CASP-8。激活的CASP-8随后裂解并激活下游效应CASP，如CASP-3和CASP-7。这些效应CASP作用于不同的细胞底物，最终导致细胞凋亡。同时，当模式识别受体和pro-CASP-1被衔接蛋白含有CARD的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)招募时，炎症小体复合物形成。激活的CASP-1裂解GSDMD产生其N端活性片段(GSDMD-N)，在细胞膜上形成孔洞，引起细胞渗透失衡和细胞内容物释放。RIPK3和RIPK1可以形成坏死复合物。MLKL在坏死复合物内被RIPK3磷酸化激活。激活的MLKL寡聚化并转移到细胞膜，导致膜完整性丧失、离子稳态破坏和细胞内容物释放。

有趣的是，在恶性肿瘤中，PANoptosis调节基因的表达表现出明显的异质性。CASP-8表达在胶质母细胞瘤、胰腺癌和肝细胞癌中显著升高，而在小细胞肺癌、前列腺腺癌和肾细胞癌中相对降低。CASP-8借助其激活的生物发光探针Ac-IETD-Amluc反映炎症综合征。其他PANoptosis基因的表达模式在肿瘤发生和进展的不同阶段也表现出显著异质性。在前列腺癌早期阶段RIPK3表达升高，在晚期显著降低。在肝细胞癌(HCC)中，APO阳性上皮细胞与临床预后和免疫治疗反应相关。这表明程序性坏死可能在肿瘤发生过程中被启动，而随着疾病进展，癌细胞逐渐产生耐药性。PANoptosis在癌症中具有免疫激活、逆转耐药性和协同细胞毒性等治疗益处。

3 PANoptosis的检测方法
针对PANoptosis多途径串扰特征的检测方法包括功能指标、分子标志物和细胞形态学。PANoptotic细胞结合了程序性坏死、细胞焦亡和细胞凋亡的独特形态特征。在早期阶段，细胞凋亡显示核固缩和染色质边缘化。需通过血浆膜完整性测定来区分。虽然质膜上的磷脂酰丝氨酸外化表明细胞凋亡信号，但通过实时染料排阻测定法测量的膜完整性的快速进行性丧失，可作为gasdermin介导的细胞焦亡孔形成和MLKL驱动的程序性坏死膜破裂的功能读数。

综合这些多样的细胞变化仍然是一个主要挑战，因为PANoptosis的细胞器水平特征包括线粒体通透性转换孔过早开放和线粒体膜完整性迅速丧失。PANoptosis细胞也表现出细胞焦亡和程序性坏死的裂解级联反应特征，如细胞膨胀和质膜孔洞形成，驱动细胞因子释放。根据电子显微镜结果，细胞凋亡的特征是细胞萎缩、核质比增加和染色质凝集。相反，细胞焦亡和程序性坏死表现为细胞和细胞器肿胀、核糖体丢失和严重的细胞质空泡化。在超微结构水平上，PANoptotic细胞同时呈现这三种途径的特征。因此，需要将超微结构观察与严格的分子标志物和功能通路验证相结合的综合方法来全面评估PANoptosis。

检测PANoptosis的分子生物标志物需要仔细分析所有三种PCD途径中涉及的关键蛋白。在细胞凋亡过程中，CASP激活是关键检测标准，特别是可通过Western印迹、流式细胞术或免疫荧光定量的CASP-3、CASP-8和CASP-9。在细胞焦亡途径中，GSDMD的裂解和寡聚化，以及由NLRP3、ASC和CASP-1等关键生物标志物组装的炎症小体是关键过程。对于程序性坏死级联反应，分析重点是坏死小体核心的磷酸化和激活状态，包括p-/t-RIPK1、p-/t-RIPK3和p-/t-MLKL，可使用磷酸化特异性抗体检查。

在孤立的分子靶标之外，细胞器功能障碍是PANoptosis的另一个早期指标。线粒体膜电位的不稳定性可通过JC-1等荧光探针定量检测。内质网(ER)水平上，未折叠蛋白反应(UPR)的诱导表现为PERK、IRE1α和ATF6信号轴的激活，是ER应激的重要指标。通过溶酶体选择性染料可监测溶酶体功能的改变。最后，可使用非膜渗透性染料检测细胞膜通透性变化。

4 癌症中的PANoptosis：从免疫抑制到免疫刺激
4.1 PANoptosis作为一种免疫原性细胞死亡
肿瘤细胞中的PANoptosis模式可刺激先天免疫途径并预测抗肿瘤免疫治疗反应。在被认为是PANoptosis的结构因素之前，ZBP1被认定为I型干扰素(IFN)的依赖DNA激活剂，促进促炎细胞因子释放、CD8⁺ T细胞浸润和效应T细胞反应。在结直肠癌(CRC)中，PANoptosis是一种高度免疫原性的细胞死亡形式，由线粒体功能障碍驱动。cGAS/STING途径是先天免疫信号的关键促进者，介导DNA识别、ZBP-1 PANoptosome形成和炎症细胞死亡。

4.2 PANoptosis模式作为免疫抑制标志
作为宿主诱导自发性炎症细胞死亡的策略，PANoptosis分别影响免疫细胞和肿瘤细胞，塑造了肿瘤微环境(TME)。PANoptosis相关特征如AIM2、NLRP3和CASP5在TME中具有免疫原性和免疫抑制双重作用。透明细胞肾细胞癌中的免疫抑制表型可由PANs模型识别，其特征是CD4⁺ T细胞和自然杀伤(NK)细胞下调，而M2巨噬细胞和调节性T细胞增加。作为肺腺癌(LUAD)的预后预测因子，评分可独立反映受抑制的肿瘤免疫微环境和化疗耐药性。胃癌中过表达的PANoptosis相关基因定义了免疫炎症微环境，较低的评分表明对免疫治疗敏感性更高。

4.3 免疫细胞介导癌细胞发生PANoptosis的机制
作为对肿瘤微环境的微观洞察，针对PANoptosis的先天-适应性免疫协同反应值得探索。基于T细胞受体(TCR)识别肿瘤来源抗原肽-MHC复合物，刺激T细胞介导的抗肿瘤免疫。抗原呈递激活T细胞分化为细胞毒性T细胞和辅助T细胞。辅助T细胞通过分泌细胞因子对抗肿瘤，而CTL通过释放穿孔素和颗粒酶，或表达如Fas-Fas配体和TRAIL-死亡受体等信号通路触发肿瘤细胞发生包括PANoptosis的PCD。泛癌分析显示，PANoptosis基因表达模式与免疫细胞浸润相关，尤其是NK细胞释放如干扰素-γ(IFNγ)和肿瘤坏死因子α等炎性细胞因子。瘤内局部IFNγ和TNFα可抑制肿瘤生长并恢复抗程序性死亡受体1(PD-1)阻断的敏感性。溶瘤病毒可增强干扰素刺激基因表达激活PANoptosis。

4.4 PANoptosis作为肿瘤免疫逃逸机制
新证据表明，在免疫细胞活跃浸润的微环境中，PANoptosis也能促进免疫逃逸。在皮肤鳞状细胞癌中，CASP5作为PANoptosis机制的关键组成部分，发挥癌基因驱动作用，促进肿瘤细胞生长、迁移和侵袭，同时促进免疫逃逸。过度表达CASP5的肿瘤利用PANoptosis维持促肿瘤炎症微环境，而非沉默的非炎性凋亡。肿瘤DNA-RNA杂合体或双链RNA(dsRNA)可激活PANoptosome组装建立慢性炎症循环。肿瘤相关巨噬细胞可激活局部炎症小体，增强恶性细胞侵袭力，并导致进行性细胞膜穿孔破裂。此外，作为主要组织相容性复合体I类(MHC-I)抗原呈递的关键调节因子，NLRC5在食管鳞状细胞癌(ESCC)中与T细胞耗竭、免疫检查点上调和预后不良同时发生。

4.5 PANoptosis：在免疫重塑中的潜在作用
越来越多的报道表明，PANoptosis以环境依赖性方式将TME重塑为免疫原性或免疫逃逸状态。作为免疫刺激重塑机制，ROS介导的PANoptosis促进树突状细胞(DC)成熟并抑制肺癌肿瘤生长。相反，在非小细胞肺癌(NSCLC)中，肿瘤相关中性粒细胞促进PANoptosis伴随高迁移率族蛋白B1(HMGB1)过表达，通过GATA2/HMGB1/TIM3轴促成免疫逃逸。炎症小体形成调节PANoptosis抗肿瘤和促肿瘤双重功效。ZBP1增强PANoptosis抗肿瘤功效，而ADAR1通过ZBP1的Zα2结构域相互作用限制PANoptosis。线粒体损伤释放的氧化应激信号直接诱导PANoptosome组装并协调肿瘤免疫重塑。抑制糖基化相关蛋白NDUFA4L2可激活AIM2炎症小体相关PANoptosis，重塑免疫抑制微环境并增强抗肿瘤疗效。在弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中，抑制去泛素化酶USP13介导乙酰辅酶A羧化酶(ACLY)可诱导线粒体损伤促进PANoptosis，发挥抗肿瘤功效。

5 PANoptosis的治疗学意义：调控肿瘤对免疫治疗和联合治疗的反应
由于依赖单一细胞死亡途径的内在脆弱性，肿瘤可能利用其他细胞机制逃避适应性免疫清除。例如，肿瘤细胞可通过下调靶向抗原或脱落MHC-I复合物绕过T细胞识别。免疫诱导的PANoptosis为克服免疫逃逸提供了策略。

5.1 常规疗法诱导的PANoptosis
靶向PANoptosis上游调节分子可显著增强化学敏感性。DNA损伤剂的化疗疗效由PANoptosis调节。CASP8可引起对标准疗法耐药，但在胶质母细胞瘤(GBM)中能通过与PARP抑制相互作用增加电离辐射敏感性。生物活性小分子如Bavachinin(BVC)也可激活DNA损伤和ROS产生。超声放大的超小Bi2O3纳米酶通过调节线粒体功能和ROS积累触发PANoptosis。具核梭杆菌外膜 vesicles(Fn-OMVs)通过激活ZBP1并释放肿瘤抗原促PANoptosis。纳米/基因工程细胞外囊泡反复释放DAMP触发癌症免疫循环。

5.2 增敏肿瘤以响应免疫治疗及联合治疗
可将PANoptosis激活剂与临床免疫治疗结合。干扰素调节基因刺激剂DMXAA通过促进CASP8/RIPK3/ASC复合物组装在DLBCL中诱导PANoptosis。免疫细胞产生IFN-γ和TNF-α可诱导PANoptosis，且其诱导能力决定免疫治疗反应。DNA错配修复缺陷细胞中联合IFN-γ和TNF-α治疗可诱导PANoptosis，而错配修复 proficient(pMMR)肿瘤细胞表现出通路缺陷和耐药性。纳米制剂可诱导PANoptosis和铁死亡以激活免疫治疗。化疗诱导的DNA损伤可通过在TME内触发PANoptosis重塑免疫细胞反应。强效抗癌剂CBL0137诱导巨噬细胞中ZBP1依赖性PANoptosis。在铁死亡和PANoptosis之间关联ROS的相互作用并提出潜在共调节疗法，含硫化铁的纳米制剂双重激活铁死亡和PANoptosis以挽救免疫抑制。

6 未来展望
尽管在免疫治疗和联合治疗中触发PANoptosis显示出卓越的抗肿瘤性能，但严重免疫逃逸和高度免疫抑制微环境仍是主要障碍。代谢重编程是恶性肿瘤中PANoptosis敏感性的潜在决定因素。目前挑战在于能否优先激活PANoptosis而非其他细胞死亡途径，关键在于描绘控制PANoptosome组装的精确上游靶标。PANoptosis对TME的影响是双向的，既能刺激抗肿瘤免疫，又能促进肿瘤进展。这种矛盾结果主要由半胱天冬酶-8(CASP8)主导。作为PANoptosome组装的核心结构成分，CASP8在癌症中发挥依赖于双面作用。激活的CASP8通过诱导细胞凋亡抑制肿瘤，而肿瘤中CASP8可被磷酸化以阻断pro-CASP8成熟从而促进代谢。多程序性细胞死亡途径在TME中复杂互联，未来PANoptosis-铁死亡联合策略应通过纳米平台放大应激驱动重塑。鉴于PANoptosis的免疫重塑特征，研究需转向在大型肿瘤队列中的观察，并利用纳米技术耐受性低pH缺氧特征精确递送PANoptosis诱导剂。

7 结论
作为新被认可的PCD形式，PANoptosis已成为肿瘤学中的潜在靶点。多靶向细胞死亡程序探索具有克服当前治疗抗性并提供精准个性化治疗的前景。