大鼠心肌细胞和人类心脏组织中的肌肽相关代谢

《The FASEB Journal》：Carnosine-Related Metabolism in Rat Cardiomyocytes and Human Heart Tissue

　　

肌肽在健康与疾病心脏模型中的治疗潜力充满前景；然而，对心脏组织中肌肽和β-丙氨酸代谢的理解尚不充分。探究这些化合物在心脏组织中的代谢途径，对于确定其在体内补充研究中的可行性至关重要。研究人员开展了两项独立研究。研究1探究了心肌细胞对外源性肌肽和β-丙氨酸的摄取，以及这种摄取对肌肽和β-丙氨酸相关酶及转运体基因表达的影响。研究2探究了人类心脏组织是否表达肌肽和β-丙氨酸代谢蛋白，以及肌肽和β-丙氨酸的内源性浓度。在研究1中，用0.1–10.0?mM的肌肽或β-丙氨酸处理分化后的H9c2细胞4、24和72小时。使用实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）在4小时测量基因表达，并使用氨基酸分析仪在所有时间点分析氨基酸和含组氨酸二肽（HCD）浓度。在研究2中，使用高效液相色谱-电喷雾电离-串联质谱（HPLC-ESI⁺-MS/MS）分析死后人类心脏心室样本（n?=?16）中的肌肽和β-丙氨酸，并使用蛋白质免疫印迹（Western blot）分析代谢相关蛋白。H9c2心肌细胞表达与肌肽和β-丙氨酸代谢相关的基因，但β-丙氨酸转氨酶（AGXT2）除外。肌肽补充未影响基因表达，而β-丙氨酸降低了转运体TAUT和PHT1的表达。外源提供的肌肽和β-丙氨酸均被心肌细胞摄取并积累。肌肽和β-丙氨酸相关的酶和转运体存在于人类心脏心室中。结论：心肌细胞和人类心脏表达摄取β-丙氨酸和合成肌肽所需的酶和转运体。

**论文解读文章：大鼠心肌细胞与人类心脏组织中的肌肽相关代谢研究**

**研究背景与问题**
肌肽（carnosine，β-丙氨酰-L-组氨酸）是一种多功能含组氨酸二肽（HCD），在骨骼肌中含量丰富，具有酸碱缓冲、抗氧化、抗糖化及调节钙离子（Ca²⁺）动力学等生理功能。近年来，肌肽在心脏保护中的潜力受到关注：研究显示肌肽可改善离体大鼠心脏的兴奋-收缩耦联和收缩力，而肌肽合酶（CARNS1）敲除大鼠出现心脏功能障碍，心脏特异性过表达CARNS1则能保护心肌免受缺血-再灌注损伤。然而，心脏组织中肌肽与β-丙氨酸的代谢机制尚不明确，尤其是前体氨基酸的转运、HCD的合成调控以及人类心脏组织是否表达相关代谢分子。现有研究仅在小鼠中观察到口服β-丙氨酸后心肌肌肽水平升高，但缺乏系统性的细胞与人类组织证据。因此，明确心脏细胞能否摄取外源性肌肽和β-丙氨酸、是否具备合成肌肽的分子基础，是评估肌肽用于心血管疾病治疗的前提。

**研究内容与结论**
研究人员开展了两项互补研究。研究1使用大鼠心室心肌母细胞来源的H9c2细胞（分化后），探究外源性肌肽和β-丙氨酸的摄取、积累及其对相关基因表达的影响。研究2分析死后人类心脏心室样本（n=16，来自巴西圣保罗大学生物样本库），检测内源性肌肽和β-丙氨酸浓度及代谢相关蛋白表达。主要结论：H9c2心肌细胞和人类心脏组织均表达肌肽和β-丙氨酸代谢所需的酶及转运体；外源性肌肽和β-丙氨酸可被心肌细胞直接摄取并以完整形式积累；但β-丙氨酸补充在72小时内未诱导HCD合成，提示肌肽合酶活性可能是限速步骤。该研究发表于《The FASEB Journal》。

**关键技术方法**
研究1采用大鼠心室心肌母细胞系H9c2，经10 nM全反式视黄酸诱导分化7天，随后用0.1–10.0 mM肌肽或β-丙氨酸处理4、24、72小时。使用实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测4小时时11个代谢相关基因的表达（CARNS1、CNDP1、CNDP2、TAUT、PAT1、PEPT1、PEPT2、PHT1、PHT2、GABA-T、AGXT2），以18S为内参。使用氨基酸分析仪（Biochrom 30）测定细胞内和细胞外氨基酸及HCD浓度。研究2使用高效液相色谱-电喷雾电离-串联质谱（HPLC-ESI⁺-MS/MS）定量人类心脏心室样本中肌肽和β-丙氨酸，以CAR-d4为内标；使用蛋白质免疫印迹（Western blot）定性检测CARNS1、CNDP2、TAUT、PAT1、PHT1、PHT2蛋白表达。样本来源：16例尸检心室壁组织，储存于液氮气相中。

**研究结果**
**3.1 急性肌肽孵育增加H9c2心肌细胞内的肌肽水平**
通过氨基酸分析发现，外源性肌肽孵育后，细胞内肌肽在所有浓度（除0.1 mM）和时间点均被检测到，且随浓度升高而增加；10.0 mM肌肽孵育72小时还显著提高了细胞内β-丙氨酸水平（p=0.0013），但组氨酸和牛磺酸无变化。细胞外培养基中检测到游离β-丙氨酸和组氨酸增加，提示肌肽可能被血清肌肽酶水解。

**3.2 急性β-丙氨酸孵育增加H9c2心肌细胞内的β-丙氨酸浓度**
细胞内β-丙氨酸在大多数浓度和时间点显著升高（除0.1 mM的4和24小时），但未检测到细胞内肌肽或鹅肌肽（anserine）的积累，组氨酸水平亦无变化。细胞外培养基中未检测到HCD增加。

**3.3 急性β-丙氨酸孵育导致H9c2心肌细胞内的牛磺酸耗竭与细胞外牛磺酸积累**
β-丙氨酸处理显著降低细胞内牛磺酸水平（所有浓度和时间点，除0.1 mM的4和72小时），同时细胞外牛磺酸升高（4和24小时），提示β-丙氨酸与牛磺酸竞争TAUT转运体，并促进牛磺酸外排。

**3.4 H9c2心肌细胞表达肌肽相关酶和转运体**
RT-qPCR检测到CARNS1、CNDP1、CNDP2、TAUT、PAT1、PEPT1、PEPT2、PHT1、PHT2、GABA-T基因表达，但未检测到AGXT2。

**3.5 急性肌肽孵育不影响肌肽相关酶和转运体基因表达**
所有浓度肌肽处理4小时未改变CARNS1、CNDP1、CNDP2、TAUT、PAT1、PEPT1、PEPT2、PHT1、PHT2、GABA-T的表达（p>0.05）。

**3.6 急性β-丙氨酸孵育下调TAUT和PHT1基因表达**
β-丙氨酸处理4小时显著降低TAUT表达（0.5 mM: ?62%，p=0.0151；1.0 mM: ?54%，p=0.0211；10.0 mM: ?59%，p=0.0275）和PHT1表达（除5.0 mM外，所有浓度下降35%–66%，p<0.05），但未影响其他基因。

**3.7 人类心脏中存在肌肽、β-丙氨酸及相关酶和转运体**
HPLC-MS/MS检测到人类心脏心室样本中肌肽（0.01–0.31 mmol·kg^?1干重）和β-丙氨酸（约1–5 mmol·kg^?1干重），β-丙氨酸浓度约为肌肽的30倍（p<0.0001）。免疫印迹证实CARNS1、CNDP2、TAUT、PAT1、PHT1、PHT2蛋白存在，但存在较大的个体间变异。

**讨论与结论**
研究人员总结，H9c2心肌细胞和人类心脏组织均表达摄取β-丙氨酸和合成肌肽所需的酶与转运体，外源性肌肽和β-丙氨酸可直接被心肌细胞摄取。然而，β-丙氨酸补充未在72小时内导致HCD积累，可能由于心肌中CARNS1酶活性较低（Kcat<1/秒），且心肌中酶活性比骨骼肌低约10倍。此外，β-丙氨酸与牛磺酸竞争TAUT转运体导致牛磺酸耗竭，其临床意义尚不明确。人类心脏中肌肽和β-丙氨酸含量存在较大个体差异，可能与供体健康状况、死后处理时间等因素有关。研究局限性包括使用大鼠细胞系、仅检测单时间点基因表达、人类样本为死后组织且可能来自疾病患者。结论：H9c2大鼠心室心肌细胞和人类心脏心室样本表达肌肽和β-丙氨酸代谢所需的酶和转运体；H9c2细胞证明外源性肌肽和β-丙氨酸能以完整形式被摄取和积累，提示体内补充研究的潜在可行性。