人牙髓干细胞分泌组的大规模生产用于关节软骨再生

《Stem Cells International》：Large-Scale Production of Secretome From Human Dental Pulp Stem Cells for Articular Cartilage Regeneration

　　

关节软骨退变可导致关节功能进行性丧失，最终引发全关节失效。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)用于软骨再生的研究已证实有效；然而，其临床应用的困难促使研究者探索其他策略，例如使用MSC分泌组而非细胞本身。研究人员的目的是建立一种培养系统，以获取大量成分可控且已知的、具有诱导关节软骨再生潜力的MSC分泌组。研究人员将嵌入藻酸盐/琼脂糖微珠中的人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)在恒定搅拌及周期性培养基更换的生物反应器中培养。收集分泌组并根据已知的软骨标志物（TGF-β1、SERPINE1、miR-140、miR-675、miR-23a、miR-204、miR-211、miR-337-5p）进行表征。进行代谢组和蛋白质组分析以详细表征收集的分泌组。收集的分泌组的软骨形成潜力在利用人原代软骨细胞在藻酸盐-琼脂糖支架上进行三维培养的体外模型中进行了测试。研究人员的系统允许从hDPSCs的强化培养中获得1200 mL分泌组。在该平台上培养的细胞保持存活且处于活跃的合成代谢状态，分泌大量的促软骨生成介质。各批次分泌组间的变异性较低，且收集的分泌组在体外诱导了原代软骨细胞分化。基因组、代谢组和蛋白质组数据显示，平台上的hDPSCs增殖并获得软骨细胞样表型。这些细胞分泌界定有利于软骨再生的微环境的介质，这进一步得到了体外分化模型证据的支持。研究人员的平台允许生产具有受控成分和软骨形成诱导潜力的大体积分泌组。这是后续使用体内实验模型分析所获分泌组研究的必要临床前研究。

该研究发表于《Stem Cells International》。关节软骨是一种缺乏骨膜的透明软骨，其再生能力有限，退变过程不可逆，常由骨关节炎或创伤引发，最终导致关节功能丧失并严重影响患者生活质量。现有的微钻孔、自体软骨移植及关节假体植入等治疗手段存在疗效不足或使用寿命短等局限，尤其不适用于年轻患者。间充质干细胞(MSCs)虽在软骨再生中显示出减轻疼痛与炎症的益处，但其临床应用面临致瘤性、感染传播风险及异质性等问题。研究表明MSCs的再生效应主要源于其分泌的抗炎与促再生生物分子集合即分泌组(secretome)，该集合能修饰组织微环境。然而，传统二维培养系统难以控制细胞动态，且微环境影响MSCs行为，导致分泌组成分异质性强、表征不足，阻碍了标准化临床产品的开发。因此，研究人员旨在开发一种可重复、可扩展的培养系统，以生产已知成分且具有软骨形成潜力的大量MSCs分泌组，并选用具有强增殖与软骨形成潜能的人牙髓干细胞(hDPSCs)作为细胞来源，结合三维水凝胶环境与生物反应器技术开展本研究。

研究人员为开展研究用到的主要关键技术方法包括：从5名不同人类供体的第三磨牙分离hDPSCs及从健康供体关节软骨分离原代软骨细胞；设计生物反应器优化藻酸盐/琼脂糖水凝胶微珠制备及实现恒定搅拌与连续培养基交换的高密度三维培养；利用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)分析微小RNA(miRNA)表达，酶联免疫吸附测定(ELISA)量化蛋白浓度；采用质子核磁共振(¹H-NMR)进行代谢组学分析，高分辨质谱(HRMS)结合diaPASEF模式的蛋白质组学分析；通过免疫荧光(IF)评估胶原表达，活死细胞染色评估活力，透射电子显微镜(TEM)观察超微结构，以及力学压缩测试评估微珠弹性模量。

研究结果如下：

3.1. First Phase: Optimization of Bead Manufacturing System

研究人员通过调节蠕动泵转速优化微珠制备，确定799转速即约4 rpm产生最规则微珠；优化水凝胶成分为3%藻酸盐与4%琼脂糖，兼顾高重现性与操作性，获得平均直径2.0±0.6 mm的微珠，生产效率约50微珠/分钟。

3.2. Second Phase: Optimization of Culture System

研究人员评估细胞密度，选定2×10⁶ cells/mL初始密度，培养2周后细胞数翻倍且活性无显著死亡；在软骨诱导培养基中培养至4周，hDPSCs呈圆形聚集成簇，F-actin微丝在细胞间连接处凝集，II型胶原(COL2A1)与聚集蛋白聚糖(ACAN)表达增加，I型胶原(COL1A1)降至 undetectable 水平；TEM显示细胞具分泌表型，微珠弹性模量显著增加，Periodic acid-Schiff(PAS)染色证实糖胺聚糖(GAGs)分泌随培养时间增加。

3.3. Third Phase: Characterization of Secretome

研究人员分析早期与晚期分泌组，RT-qPCR显示早期分泌组中miR-23a、miR-204、miR-211、miR-337-5p、miR-140、miR-675均检出，晚期部分缺失且多数miRNA在早期表达更高；ELISA显示TGF-β1与SERPINE1在分泌组中显著高于对照培养基，SERPINE1在早期更高。¹H-NMR代谢组学检出24种代谢物，早期分泌组2-氧丁酸盐与N-乙酰谷氨酸显著升高，涉及氨基酸生物合成等通路；蛋白质组学显示早期分泌组鉴定蛋白数为对照4倍，筛选出203种与软骨发育相关的蛋白如TGFB1、COL2A1、MMP2、SERPINE1等显著富集。

3.4. Fourth Phase: Validation of Secretome

研究人员将原代软骨细胞分别暴露于早期分泌组、软骨诱导培养基及增殖培养基，在2D与3D藻酸盐/琼脂糖模型中培养4周；结果显示分泌组诱导COL2A1与ACAN表达显著提升，COL1A1不表达，细胞形成大聚集体，且在3D模型中聚集直径近乎对照组两倍，效果优于或与软骨诱导培养基相当。

讨论部分总结指出，MSCs通过分泌组调节微环境促进再生，但临床转化受限于扩增、稳定性及异质性。相比骨髓与脂肪来源MSCs，hDPSCs增殖力强更适合规模化生产。研究通过三维水凝胶模拟缺氧与软骨诱导微环境，设计生物反应器实现标准化大规模培养，获得低批次变异的1200 mL分泌组。表征证实早期分泌组即培养前2周富含促软骨生成介质、特定miRNA、代谢物及软骨相关蛋白，且保留分子量大于30 kDa的成分与细胞外囊泡。体外验证表明该分泌组能有效诱导软骨分化，避免细胞治疗风险。尽管水凝胶刚度低于天然软骨，但未阻碍分化，未来可优化缺氧程度。该研究为临床转化提供了必要的临床前数据。

结论部分翻译：基因组、代谢组和蛋白质组层面的数据表明，一方面细胞在平台上保持存活、增殖并获得软骨样表型；另一方面，这些细胞处于活跃的分泌状态，并向分泌组中释放蛋白质，共同界定了有利于软骨再生的微环境。体外分化模型进一步支持了这一点，研究人员观察到分泌组具有诱导未分化软骨细胞向成熟细胞分化的潜力，这些成熟细胞分泌软骨基质的关键组分。得益于hDPSCs的高增殖及向软骨细胞分化能力，该平台的建立有望生产已知成分的大体积分泌组，这对于生成可转化为临床使用的产品至关重要。然而，鉴于软骨组织复杂的生物学特性，有必要继续利用不同的动物模型来确认体外获得的结果。