肠道来源的丁酸钠通过HDAC3/c-Myc信号轴抑制有氧糖酵解减轻肝纤维化

《The FASEB Journal》：Gut-Derived Sodium Butyrate Attenuates Liver Fibrosis by Inhibiting Aerobic Glycolysis via the HDAC3/c-Myc Signaling Axis

　　

肝纤维化仍然是一个主要的全球健康挑战，推动了对天然来源生物活性代谢物作为潜在疗法的兴趣。丁酸钠（NaB）是一种肠道微生物群来源的短链脂肪酸，具有显著的抗纤维化活性，显示出前景，但其机制尚不清楚。本研究旨在探索NaB减轻肝纤维化的分子机制。研究人员整合了生物信息学和网络药理学来预测NaB发挥抗纤维化作用的分子靶点。候选靶点通过分子对接、组织病理学、细胞热转变分析（CETSA）和表面等离子共振（SPR）进行了验证。推断的机制进一步在体外（LX-2细胞）和体内（CCl₄诱导的小鼠）通过Western blot（WB）、免疫荧光（IF）、免疫共沉淀（Co-IP）、实时定量PCR（RT-qPCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和组织病理学染色进行了验证。组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）被确认为肝纤维化的关键驱动因子。作为一种天然HDAC3抑制剂，NaB显著减轻了CCl₄诱导的肝损伤和纤维化，伴随着纤维化肝组织和LX-2细胞中HDAC3、c-Myc、糖酵解酶（HK2、PFKFB3和PKM2）以及纤维化标志物（α-SMA和I型胶原）表达的降低。机制上，NaB通过抑制HDAC3表达和去乙酰化酶活性，促进c-Myc乙酰化并下调其表达，从而抑制肝星状细胞中的糖酵解代谢重编程，发挥其抗纤维化作用。这些发现表明，NaB通过抑制HDAC3/c-Myc介导的代谢重编程减轻肝纤维化，揭示了一种肠道来源的抗纤维化机制和潜在的治疗靶点。

肝纤维化是多种慢性肝损伤（如病毒性肝炎、过量饮酒和代谢功能障碍相关脂肪性肝病）的共同病理后果，以细胞外基质（ECM）过度沉积为特征，最终导致肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌。目前全球每年约200万人死于肝病，占全因死亡的4%，但尚无获批的抗纤维化疗法。肠道-肝脏轴（gut–liver axis）通过肠道微生物群、肠屏障和肝脏之间双向通信调节肝健康，而微生物代谢物如丁酸钠（NaB）——一种由膳食纤维发酵产生的短链脂肪酸（SCFA）——具有抗炎、抗氧化和抗纤维化活性，但其分子机制尚不明确。本研究旨在从肠道-肝脏轴和代谢重编程的整合视角阐明NaB减轻肝纤维化的分子机制，为肝纤维化防治提供新理论依据和潜在治疗策略。

研究人员整合生物信息学（GEO数据库GSE25097数据集，含6例正常和40例纤维化肝组织）和网络药理学（SwissTargetPrediction预测NaB靶点，GeneCards收集肝纤维化相关基因），通过分子对接、CETSA、SPR验证候选靶点，并在体外（LX-2人肝星状细胞系）和体内（CCl₄诱导的C57BL/6J小鼠模型）使用Western blot（WB）、免疫荧光（IF）、免疫共沉淀（Co-IP）、RT-qPCR、ELISA以及组织病理学染色（H&E、Masson、Sirius Red）验证机制。研究发现，NaB通过抑制HDAC3表达和去乙酰化酶活性，促进c-Myc乙酰化依赖性降解，从而抑制有氧糖酵解关键酶（HK2、PFKFB3、PKM2）表达，进而抑制肝星状细胞（HSC）激活和纤维化。该研究发表于《The FASEB Journal》。

主要关键技术方法包括：生物信息学与网络药理学分析（利用GSE25097数据集进行KEGG富集分析，SwissTargetPrediction预测NaB靶点，GeneCards获取肝纤维化相关基因，STRING数据库构建蛋白互作网络）；分子对接（CB-Dock2服务器分析NaB与HDAC3结合能）；细胞热转变分析（CETSA）和表面等离子共振（SPR）验证直接结合；体外实验（LX-2细胞培养，HDAC3过表达及siRNA敲低，WB、IF、Co-IP、RT-qPCR、HDAC3酶活性检测、c-Myc乙酰化检测）；体内实验（CCl₄诱导小鼠肝纤维化模型，NaB低剂量250 mg/kg和高剂量500 mg/kg灌胃，水飞蓟素100 mg/kg作为阳性对照，共5组，每组6只，检测血清肝功能指标（ALT、AST）、炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-10）及肝组织病理学染色和蛋白表达）。人肝组织样本来自贵州医科大学附属医院肝胆外科，包括9例正常肝组织（肝内胆管结石或肝血管瘤远处组织）和9例纤维化肝组织（肝细胞癌瘤旁或失代偿期肝硬化移植肝）。

研究结果如下：

**3.1 NaB减轻肝纤维化潜在机制的生物信息学与网络药理学分析**
通过分析GEO数据集发现纤维化肝组织中丁酸代谢通路显著下调。SwissTargetPrediction预测NaB的18个潜在靶点，与10782个肝纤维化相关基因交叉后得到9个重叠靶点，其中HDAC3预测概率排名第一（概率=1）。分子对接显示NaB与HDAC3具有良好结合亲和力（结合能≤-5.0 kcal/mol），初步确定HDAC3为关键候选靶点。

**3.2 HDAC3参与肝纤维化进展**
对人肝组织进行IHC和WB分析，发现纤维化肝组织中HDAC3和α-SMA表达显著高于正常肝组织（n=9/组），表明HDAC3上调与肝纤维化及HSC激活相关。

**3.3 NaB通过靶向HDAC3抑制LX-2细胞激活**
在LX-2细胞中，NaB（0.5、1、2 mM）剂量依赖性地降低α-SMA和I型胶原表达。CETSA显示NaB显著增强HDAC3在49°C–65°C的热稳定性，SPR分析显示NaB与HDAC3直接结合（KD=1.26×10^-6 M），验证了HDAC3是NaB抗纤维化的关键功能靶点。

**3.4 NaB通过HDAC3/c-Myc轴阻断有氧糖酵解抑制LX-2细胞激活**
STRING数据库鉴定25个HDAC3相互作用蛋白，网络分析筛选出前5个关键蛋白（NCOR1、EP300、KDM1A、PPARG、MYC），其中MYC与肝纤维化相关。WB显示NaB剂量依赖性地降低HDAC3和c-Myc蛋白表达，Co-IP证明NaB减弱HDAC3与c-Myc的相互作用，并降低糖酵解酶（HK2、PFKFB3、PKM2）表达，提示NaB通过HDAC3/c-Myc轴抑制糖酵解重编程。

**3.5 NaB通过抑制HDAC3活性促进c-Myc乙酰化抑制LX-2细胞激活**
RT-qPCR显示NaB降低HDAC3 mRNA表达，但不影响c-Myc mRNA；HDAC3酶活性测定表明NaB显著抑制HDAC3活性。c-Myc乙酰化检测显示NaB增加c-Myc乙酰化水平同时降低其蛋白表达。HDAC3过表达可逆转NaB对c-Myc乙酰化和蛋白表达的促进作用，表明NaB通过抑制HDAC3活性促进c-Myc乙酰化依赖性降解。

**3.6 NaB通过HDAC3/c-Myc信号轴抑制LX-2细胞有氧糖酵解和激活**
HDAC3过表达增加α-SMA、I型胶原、HK2、PFKFB3、PKM2表达，并部分逆转NaB的抑制作用；siRNA敲低HDAC3则抑制c-Myc、激活标志物和糖酵解酶表达（无论是否加NaB），证实HDAC3位于c-Myc介导的糖酵解重编程上游，是NaB抗纤维化的关键分子。

**3.7 NaB改善CCl₄处理小鼠的肝纤维化和损伤**
CCl₄诱导小鼠模型（8周腹腔注射）后，NaB灌胃（250或500 mg/kg）6周。H&E、Sirius Red和Masson染色显示NaB剂量依赖性地减轻肝细胞坏死、炎症浸润和胶原沉积。ELISA显示NaB降低血清ALT、AST、TNF-α、IL-1β水平，升高IL-10水平。WB显示NaB降低肝组织中HDAC3和c-Myc表达。

**3.8 NaB通过HDAC3/c-Myc信号轴抑制有氧糖酵解改善CCl₄处理小鼠肝纤维化**
IHC、IF和WB分析显示，与模型组相比，NaB处理组肝组织中HDAC3、c-Myc、α-SMA、I型胶原、HK2、PFKFB3、PKM2表达均剂量依赖性地降低，进一步证实体内NaB通过抑制HDAC3/c-Myc介导的糖酵解重编程减轻肝纤维化。

讨论部分总结：本研究揭示了NaB通过调节代谢重编程减轻肝纤维化的新机制：NaB抑制HDAC3表达和活性，促进c-Myc乙酰化依赖性降解，抑制c-Myc对糖酵解的调控，最终抑制HSC激活和纤维化。同时，NaB可能通过增强肠屏障功能限制LPS易位，间接调节肠道-肝脏轴发挥抗炎作用。这些发现加深了对NaB抗纤维化分子机制的理解，并突出了HDAC3/c-Myc轴作为肝纤维化治疗靶点的潜力。但研究存在局限性，如动物实验样本量较小，HDAC3调控的c-Myc乙酰化位点未明确，需在更多纤维化模型（如BDL、MASLD）中验证。未来研究应结合转录组学、代谢组学和单细胞测序进一步阐明复杂调控网络。

结论：总之，这些发现表明，NaB通过抑制HDAC3/c-Myc介导的代谢重编程减轻肝纤维化，揭示了一种肠道来源的抗纤维化机制和潜在的治疗靶点。