《Letters in Drug Design & Discovery》：Integrated network pharmacology, machine learning and experimental validation reveal that ursolic acid promotes M2-like microglial polarization by targeting CYP51A1 in cerebral ischemia-reperfusion injury
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背景：脑缺血再灌注损伤（CIRI）是缺血性卒中的关键病理后果，促炎与抗炎小胶质细胞表型失衡促进其进展。熊果酸（UA）在CIRI中的神经保护机制尚不清楚。方法：研究人员从外周血转录组数据集GSE58294中鉴定卒中相关差异表达基因（DEGs）。利用SwissTa
背景：脑缺血再灌注损伤（CIRI）是缺血性卒中的关键病理后果，促炎与抗炎小胶质细胞表型失衡促进其进展。熊果酸（UA）在CIRI中的神经保护机制尚不清楚。方法：研究人员从外周血转录组数据集GSE58294中鉴定卒中相关差异表达基因（DEGs）。利用SwissTargetPrediction预测潜在UA靶点，并与DEGs取交集。通过STRING构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。应用机器学习算法（LASSO、SVM-RFE、RF）优先筛选关键靶点。单基因基因集富集分析（GSEA）探索候选基因的生物学功能。进行分子对接以评估UA与关键靶点的结合亲和力。在人小胶质细胞（HMC3）中建立氧-葡萄糖剥夺/再灌注（OGD/R）损伤模型，采用CCK-8实验、蛋白质印迹法（Western blot）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和流式细胞术评估细胞活力、关键靶蛋白表达、炎症细胞因子水平、凋亡及小胶质细胞表型标志物。结果：从GSE58294数据集中共鉴定出3545个DEGs，与UA靶点交集获得15个候选基因。机器学习分析突出NR3C1和CYP51A1为关键靶点。单基因GSEA表明，CYP51A1高表达与氨基酸降解、凋亡和炎症通路相关。分子对接显示UA与CYP51A1和NR3C1的结合能分别为?11.9和?8.4 kcal/mol。在体外，UA显著抑制OGD/R诱导的HMC3细胞中CYP51A1上调，增强细胞活力（p < 0.0001），降低炎症细胞因子产生（p < 0.0001）和凋亡（p < 0.0001），抑制M1样促炎小胶质细胞极化（p < 0.0001），并促进M2样抗炎小胶质细胞极化（p < 0.0001）。过表达CYP51A1逆转了UA的这些保护作用。结论：UA通过抑制CYP51A1并促进M2样抗炎小胶质细胞极化，减轻OGD/R诱导的小胶质细胞损伤，为CIRI治疗提供了潜在靶点。
**论文解读**
**研究背景与问题**
脑缺血再灌注损伤（CIRI）是缺血性卒中再通治疗后的关键病理过程，其机制涉及促炎与抗炎小胶质细胞表型失衡。M1样促炎小胶质细胞释放炎症介质加重神经元损伤，而M2样抗炎小胶质细胞促进组织修复。调节小胶质细胞极化被视为减轻CIRI神经损伤的重要治疗策略。熊果酸（UA）是一种天然五环三萜类化合物，具有抗氧化、抗炎和抗凋亡活性，在蛛网膜下腔出血和创伤性脑损伤中展现神经保护作用，但其在CIRI中是否通过调节小胶质细胞表型转换发挥作用尚不明确。现有研究主要集中于UA抑制NF-κB/NLRP3介导的小胶质细胞焦亡，但其他代谢相关靶点是否参与调节小胶质细胞极化仍待阐明。因此，研究人员整合网络药理学与机器学习方法，系统筛选UA在CIRI中的关键靶点，并通过体外实验验证其机制。该论文发表在《Letters in Drug Design》。
**主要技术方法**
研究人员利用网络药理学方法从GSE58294数据集（包含23例卒中患者和23例对照的外周血转录组数据）中鉴定卒中相关差异表达基因（DEGs），并通过SwissTargetPrediction预测UA靶点，取交集获得15个候选基因。随后应用三种机器学习算法（LASSO回归、支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）、随机森林（RF））进行特征选择，筛选核心靶点。通过分子对接（AutoDock Vina）评估UA与靶蛋白的结合能力。体外实验采用人小胶质细胞（HMC3）建立氧-葡萄糖剥夺/再灌注（OGD/R）模型，通过CCK-8实验、蛋白质印迹法（Western blot）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和流式细胞术检测细胞活力、蛋白表达、炎症因子、凋亡及小胶质细胞表型标志物。
**研究结果**
**3.1 鉴定CIRI与UA靶点之间的重叠基因**
通过差异表达分析，从GSE58294数据集中获得3545个DEGs（上调2579个，下调966个）。将UA预测靶点与DEGs取交集，得到15个候选基因，并通过STRING构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，揭示候选基因间的复杂调控关系。
**3.2 基于机器学习的UA在CIRI中核心靶点鉴定**
分别采用LASSO（筛选出ACP1、PPARG、NR3C1、POLB、LTB4R、GRIK1、CYP51A1）、SVM-RFE（筛选出NR3C1、ALOX5、CYP51A1、POLB）和RF（筛选出NR3C1、CYP51A1、ADAM17、ALOX5AP、RORC）进行特征选择。三种算法交集确定NR3C1和CYP51A1为共同核心靶点。
**3.3 鉴定CIRI中CYP51A1和NR3C1相关通路**
单基因GSEA显示，CYP51A1高表达样本富集于赖氨酸降解、脂肪酸代谢、细胞周期、凋亡及NOD样受体信号通路等；NR3C1高表达样本富集于脂肪酸代谢、WNT信号通路、凋亡等通路，提示二者可能通过代谢、炎症及凋亡通路参与CIRI。
**3.4 UA结合CYP51A1并抑制OGD/R诱导的HMC3细胞中CYP51A1表达**
分子对接显示UA与CYP51A1和NR3C1的结合能分别为-11.9 kcal/mol和-8.4 kcal/mol，表明UA对CYP51A1具有更强亲和力。CCK-8实验确定UA在9 μM以下无细胞毒性，且UA浓度依赖性地提高OGD/R损伤后HMC3细胞活力。Western blot显示UA显著抑制OGD/R诱导的CYP51A1蛋白上调，对NR3C1影响较弱，因此选择CYP51A1作为后续研究关键靶点。
**3.5 UA通过抑制CYP51A1表达减轻OGD/R诱导的凋亡并调节M1样/M2样小胶质细胞极化**
过表达CYP51A1逆转了UA对OGD/R诱导的CYP51A1上调的抑制。CCK-8实验表明UA改善细胞活力，该保护作用被CYP51A1过表达显著减弱。ELISA显示UA降低OGD/R诱导的IL-1β和TNF-α水平，CYP51A1过表达部分消除该抗炎效应。流式细胞术显示UA减少OGD/R诱导的凋亡，降低CD86阳性M1样小胶质细胞比例，增加CD206阳性M2样小胶质细胞比例，而CYP51A1过表达部分逆转这些调节作用。
**总结讨论与结论**
研究人员指出，CIRI涉及免疫细胞功能障碍和炎症反应，促进小胶质细胞从M1向M2表型转换是改善预后的关键靶点。本研究首次通过整合网络药理学、机器学习和体外实验，揭示UA通过抑制CYP51A1表达，降低炎症因子IL-1β和TNF-α水平，抑制细胞凋亡，并促进小胶质细胞向M2抗炎表型极化，从而减轻OGD/R诱导的炎症损伤。该发现不仅丰富了UA的药理机制，也为靶向小胶质细胞极化治疗CIRI提供了新策略。研究结论：UA通过抑制CYP51A1并促进M2样抗炎小胶质细胞极化，减轻OGD/R诱导的小胶质细胞损伤，为CIRI治疗提供了潜在靶点。
