《Letters in Drug Design & Discovery》：A network pharmacology-based study on the mechanism of naringin alleviating LPS-induced HK2 cell injury and inhibiting ferroptosis via regulating the PPARγ-p53 pathway
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网络药理学预测PPARγ（过氧化物酶体增殖物激活受体γ）-p53（肿瘤抑制蛋白p53）通路是介导柚皮苷（naringin）作用的关键靶点。柚皮苷调节PPARγ/p53通路活性以对抗LPS（脂多糖）诱导的HK2（人肾皮质近曲小管上皮细胞）细胞损伤。柚皮苷在体外减
网络药理学预测PPARγ（过氧化物酶体增殖物激活受体γ）-p53（肿瘤抑制蛋白p53）通路是介导柚皮苷（naringin）作用的关键靶点。柚皮苷调节PPARγ/p53通路活性以对抗LPS（脂多糖）诱导的HK2（人肾皮质近曲小管上皮细胞）细胞损伤。柚皮苷在体外减轻LPS诱导的HK2细胞损伤并抑制铁死亡（ferroptosis）。
**研究背景与问题**
脓毒症（sepsis）是一种由感染引发的全身性炎症综合征，常导致多器官功能障碍，其中肾脏易受损。脓毒症相关急性肾损伤（SA-AKI）在脓毒症患者中发病率高达30%–50%，且死亡率显著升高。脂多糖（LPS）作为革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，通过激活Toll样受体4（TLR4）等信号通路，在肾组织中引发强烈的炎症级联反应，最终损伤肾小管上皮细胞。HK2细胞（人肾皮质近曲小管上皮细胞）是研究LPS诱导肾细胞损伤的经典体外模型。天然黄酮类化合物柚皮苷（naringin）具有抗炎、抗氧化和细胞保护活性，已在多种器官损伤模型（如心肌缺血再灌注、肝损伤、糖尿病肾病）中显示出保护作用，但其在SA-AKI中是否通过干预铁死亡（ferroptosis）发挥肾保护作用，以及具体分子机制尚不明确。铁死亡是一种以铁过载、活性氧（ROS）积累和脂质过氧化为特征的程序性细胞死亡形式，参与多种肾脏疾病的发生发展。因此，阐明柚皮苷在LPS诱导HK2细胞损伤中的作用及其对铁死亡的调控机制，可为SA-AKI的靶向治疗提供新理论基础。
**研究内容与结论**
研究人员利用网络药理学（network pharmacology）预测柚皮苷调控SA-AKI中铁死亡的潜在靶点，随后通过体外实验验证柚皮苷对LPS诱导HK2细胞损伤的保护作用及其分子机制。网络药理学分析发现，柚皮苷、铁死亡与SA-AKI三者之间存在14个重叠基因，其中枢纽基因包括TP53、IL6和PPARG（过氧化物酶体增殖物激活受体γ）。分子对接显示柚皮苷与PPARγ和p53具有良好结合能。体外实验证实，柚皮苷剂量依赖性地逆转LPS诱导的PPARγ下调与p53上调，并减轻细胞活力下降、凋亡增加及炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）释放。进一步通过PPARγ特异性抑制剂GW9662和siRNA敲低实验，证明柚皮苷通过激活PPARγ抑制p53，进而减少ROS、脂质ROS、丙二醛（MDA）和Fe2?水平，恢复谷胱甘肽（GSH）含量，上调铁死亡抑制蛋白GPX4（谷胱甘肽过氧化物酶4）并下调促铁死亡蛋白ACSL4（酰基辅酶A合成酶长链家族成员4）。结论：柚皮苷通过激活PPARγ并抑制p53，减轻LPS诱导的HK2细胞损伤和铁死亡，为SA-AKI的防治提供了新机制框架。该论文发表在《Letters in Drug Design》。
**主要技术方法**
研究采用以下关键技术：（1）网络药理学：利用FerrDb、GeneCards、SwissTargetPrediction和CTD数据库预测靶点，通过Venn图筛选交集基因；STRING平台构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，Cytoscape识别枢纽基因。（2）GO和KEGG富集分析：使用DAVID平台对交集基因进行功能注释和通路分析。（3）分子对接：从RCSB PDB获取PPARγ（PDB ID: 9V8G）和p53（PDB ID: 8E7A）的晶体结构，使用AutoDock Vina进行对接。（4）体外细胞实验：HK2细胞（购自Procell）经LPS（10 μg/mL）诱导损伤，柚皮苷（10、20、50 μM）预处理，PPARγ抑制剂GW9662（10 μM）或PPARγ siRNA干预。检测指标包括细胞活力（CCK-8）、凋亡（流式细胞术）、炎症因子（ELISA）、ROS（荧光探针DCFH-DA）、脂质过氧化（C11-BODIPY 581/591）、MDA、GSH、Fe2?水平，以及PPARγ、p53、GPX4、ACSL4蛋白表达（Western blot）。
**研究结果**
**3.1 柚皮苷、铁死亡与SA-AKI靶点收集及交集靶点获取**
通过Venn图分析，柚皮苷、SA-AKI和铁死亡三者共有14个重叠基因，PPI网络显示枢纽基因包括TP53、IL6和PPARG，提示这些基因在介导三者的相互作用中起关键作用。
**3.2 GO和KEGG分析**
GO富集分析显示，生物过程（BP）主要涉及RNA聚合酶II对转录的正调控、基因表达正调控和氧化应激反应；细胞组分（CC）富集于胞质溶胶、细胞质和细胞核；分子功能（MF）以蛋白质结合、相同蛋白质结合和酶结合为主。KEGG通路富集突出癌症通路、IL-17信号通路和脂质与动脉粥样硬化通路，表明柚皮苷可能通过调节转录活性、炎症信号和脂质代谢干预铁死亡。
**3.3 柚皮苷增强LPS诱导HK2细胞中PPARγ表达并抑制p53水平**
分子对接显示柚皮苷与PPARγ结合能为?9.0 kcal/mol，与p53为?7.9 kcal/mol。CCK-8实验表明5–50 μM柚皮苷无细胞毒性。Western blot显示，LPS刺激显著降低PPARγ并升高p53，柚皮苷剂量依赖性地逆转这一变化；GW9662可部分逆转柚皮苷的作用，PPARγ siRNA敲低后柚皮苷对p53的抑制仍存在但减弱，提示柚皮苷主要通过PPARγ抑制p53，同时存在部分非依赖途径。
**3.4 柚皮苷通过PPARγ减轻LPS诱导的细胞损伤**
CCK-8结果显示，LPS降低细胞活力，柚皮苷恢复活力，GW9662部分削弱这一保护作用。流式细胞术显示，LPS升高凋亡率，柚皮苷抑制凋亡，GW9662部分逆转。ELISA检测表明，LPS上调TNF-α、IL-6和IL-1β，柚皮苷降低这些因子，GW9662部分恢复其水平。结论：柚皮苷以PPARγ依赖的方式减轻LPS诱导的细胞损伤。
**3.5 柚皮苷通过PPARγ减轻LPS诱导的铁死亡**
ROS荧光成像和定量分析显示，LPS显著增加ROS，柚皮苷降低ROS，GW9662部分逆转。C11-BODIPY 581/591探针流式细胞术检测脂质过氧化，LPS升高脂质ROS，柚皮苷降低，GW9662部分反转。MDA和Fe2?水平检测结果类似：LPS升高，柚皮苷降低，GW9662部分逆转。GSH检测：LPS降低GSH，柚皮苷升高，GW9662部分抑制。Western blot显示，LPS降低GPX4、升高ACSL4，柚皮苷上调GPX4、下调ACSL4，GW9662逆转这些变化。结论：柚皮苷通过PPARγ减轻LPS诱导的铁死亡。
**讨论与结论总结**
讨论部分指出，网络药理学分析揭示的14个重叠基因（包括TP53、IL6、PPARG）表明柚皮苷可能通过抗氧化、抗炎和调控细胞存活等多维度干预SA-AKI进程。GO和KEGG结果进一步支持柚皮苷通过调节转录活性、抑制IL-17信号通路和纠正脂质代谢异常来阻断铁死亡。分子对接和体外实验验证了柚皮苷对PPARγ-p53轴的调控作用：PPARγ激活可抑制NF-κB等促炎通路并减少ROS，而p53通过上调ACSL4、抑制SLC7A11和GPX4促进铁死亡。GW9662实验证实PPARγ是柚皮苷发挥保护作用的关键分子枢纽。研究局限性包括：仅基于HK2细胞系，缺乏体内模型验证；未进行形态学铁死亡检测（如FerroOrange染色）；未深入探究PPARγ上游调控机制及p53与铁死亡相关蛋白的相互作用细节；未通过生物物理方法（如CETSA、SPR）确认柚皮苷与PPARγ的直接结合。未来需结合体内实验和多组学分析进一步扩展应用价值。
**研究结论**：总体而言，本研究证明柚皮苷通过激活PPARγ并抑制p53，减轻LPS诱导的HK2细胞损伤和铁死亡，为其在SA-AKI中的潜在应用提供了新的机制框架。这些发现为开发新型抗SA-AKI药物提供了潜在靶点，未来研究应结合体内实验和多组学分析进一步拓展其应用价值。
