小鼠胚胎亚板神经元亚群的转录组分析

《Journal of Anatomy》：Transcriptomic profiling of subpopulations of mouse embryonic subplate neurons

　　

亚板神经元（SpNs）是发育中大脑皮层最早产生和成熟的神经元之一。它们起源于多种来源，可根据形态、连接性和基因表达分为若干亚群。这些神经元在皮层回路形成中发挥关键作用，但其细胞多样性和转录动态仍未完全阐明。本研究利用Lpar1-EGFP和NeuroD1/Cre-ERT2（D1B）报告基因小鼠系，表征了胚胎小鼠皮层中SpN亚群的转录组图谱。研究人员采用了互补的基因表达谱分析方法，包括批量微阵列分析（bulk microarray analysis）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和Visium空间转录组学（Visium spatial transcriptomics）。在胚胎第17天（E17），scRNA-seq识别出10个不同的Lpar1-EGFP阳性SpN聚类，空间转录组学将其映射到特定的皮层区域。尽管许多标记物在亚板区域内富集，但其他标记物延伸至海马体和腹侧苍白球（包括杏仁核、屏状核和终末梨状核）。Lpar1-EGFP和D1B小鼠系的整合分析揭示了重叠和独特的基因表达特征，突出了亚板身份的动态标记物。E15和E17数据集之间的比较显示出显著的转录变化，提示SpN亚群存在快速的发育变化。通过原位杂交（in situ hybridization）和RNAscope验证，确认了关键标记物（包括Cryab、Cdh13、Nr4a2和Lmo3）的选择性。总之，这些发现为进一步分类SpN亚型以及识别瞬时与持久群体的候选标记物提供了分子框架，从而增进了对早期皮层发育的理解。

**论文解读：小鼠胚胎亚板神经元亚群的转录组分析**

**研究背景与问题**
亚板神经元（subplate neurons, SpNs）是发育中大脑皮层最早产生和成熟的神经元，起源于多种来源，可根据形态、连接性和基因表达分为多个亚群。这些神经元在皮层回路形成中发挥关键作用，但其细胞多样性和转录动态仍不完全清楚。此前的研究多聚焦于产后或成年阶段的层6b神经元，对胚胎期SpN的分子异质性和发育动态缺乏系统解析。现有标记物（如Lpar1-EGFP和NeuroD1-CreERT2，即D1B）可标记胚胎SpN，但不同标记群体间的差异及瞬时与持久群体的区分尚不明确。因此，有必要通过多维度转录组学方法，系统描绘胚胎SpN的分子特征，为理解皮层早期发育和神经发育疾病提供基础。

**研究内容与结论**
研究人员利用Lpar1-EGFP和NeuroD1-CreERT2（D1B）两种报告基因小鼠系，结合批量微阵列分析、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和Visium空间转录组学，在胚胎第15天（E15）、E17和E18三个时间点，对胚胎SpN进行了全面的转录组分析。共鉴定出Lpar1-EGFP阳性细胞的10个聚类，其中SP聚类（Cl.8）表达Igfbp3和Nr4a2；D1B阳性细胞也形成10个聚类，SP聚类（Cl.0）表达Mef2c和Lmo3。整合分析揭示了重叠和独特的基因表达特征，并鉴定出33个共享的标记基因，其中部分与自闭症谱系障碍相关。通过原位杂交和RNAscope验证了Cryab、Cdh13、Nr4a2和Lmo3等关键标记物的选择性表达。此外，空间转录组学将SP聚类特异性映射到皮层亚板区域，并发现Npy在Lpar1-EGFP和D1B群体中分别表达于GABA能神经元和兴奋性SpN。这些发现为分类SpN亚型、区分瞬时与持久群体提供了分子框架，显著增进了对早期皮层发育的理解。该研究发表在《Journal of Anatomy》。

**主要关键技术方法**（不超过250字）
研究人员采用了三种互补的转录组学方法：1）批量微阵列分析：对荧光激活细胞分选（FACS）分离的Lpar1-EGFP阳性细胞（E15和E18）进行基因表达谱分析，以全皮层为对照；2）单细胞RNA测序（scRNA-seq）：对E17的Lpar1-EGFP和D1B-CreERT2（Ai14）小鼠的FACS分离细胞进行测序，使用Fluidigm C1系统构建文库，并通过Seurat进行聚类分析；3）Visium空间转录组学：将E17小鼠脑片的空间表达数据与scRNA-seq数据整合，通过锚定法映射细胞类型。样本来源包括Lpar1-EGFP小鼠（E15、E17、E18）和D1B/Ai14小鼠（E17）的胚胎背侧皮层。此外，还使用原位杂交（ISH）和RNAscope对关键标记物进行了空间验证。

**研究结果**
**3.1 微阵列分析（E15和E18的Lpar1-EGFP阳性SP细胞）**
通过FACS分选获得E15和E18的Lpar1-EGFP阳性细胞，微阵列分析鉴定出与全皮层相比上调>2倍的基因，分别有131个（E15）和691个（E18），其中61个在两阶段均表达。与先前报道的SP表达基因重叠后，26个基因得到确认，包括Rnd2、Rasgef1b、Mfap4、Shb、Nrp1和Fgfr1等，这些基因在Allen脑图谱ISH数据中显示SP区域富集。

**3.2 单细胞RNA测序分析（E17背侧皮层Lpar1-EGFP阳性细胞）**
scRNA-seq揭示10个聚类，包括皮层（CTX1-3）、中间前体细胞（IP）、心室区前体细胞（VZp）、海马（HP）、GABA能神经元（GABA）、脉络丛（ChPx）、SP（Cl.8）和杂项（Misc）。SP聚类表达Igfbp3和Nr4a2；微阵列鉴定的6个基因在不同聚类中表达各异。

**3.3 空间映射（整合Lpar1-EGFP scRNA-seq与Visium数据）**
所有流图显示Visium SP聚类7与Lpar1聚类8对应最强。空间特征图表明聚类8特异性映射到SP层，而其他聚类（如海马、GABA能神经元、脉络丛）对应不同区域，提示分选过程中存在少量污染。

**3.4 D1B标记群体与Lpar1-EGFP的部分重叠**
D1B阳性细胞中仅22%与Lpar1-EGFP双阳性，表明两者标记不同亚群。D1B的scRNA-seq同样产生10个聚类，SP聚类（Cl.0）表达Mef2c和Lmo3，此外还包含Cajal-Retzius细胞、神经前体细胞、内皮细胞、小胶质细胞等非SP类型。

**3.5 整合两个数据集的单细胞RNA-seq分析**
将Lpar1-EGFP和D1B数据整合后得到6个聚类：IP、CTX、VZp、SP（Cl.3）、CR（Cajal-Retzius细胞）和GABA。SP聚类表达Hs3st4和Nr4a2。六基因特征图显示其表达在聚类间存在差异。

**3.6 整合scRNA-seq数据与E17 Visium数据的空间映射**
所有流图显示Visium SP聚类7与整合聚类3对应。空间特征图确认聚类3特异性富集于SP层，而聚类4（海马）和聚类5（GABA）映射至其他区域。

**3.7 标记基因重叠与空间验证**
三个SP相关聚类（Lpar1聚类8、D1B聚类0、整合聚类3）的top 20标记基因中，33个基因重叠，分为7个亚型。RNAscope证实Cdh13、Nr4a2和Lmo3在细胞水平呈共表达，存在三阳性、双阳性和单阳性细胞。

**3.8 胚胎期SP标记基因的表达模式**
Visium分析鉴定出SP层高表达基因，包括Cryab和Npy。Cryab在CTGF阳性SP细胞中特异性表达；Npy在Lpar1-EGFP群体中表达于GABA能聚类，而在D1B群体中表达于SP聚类，提示其在不同细胞类型中的动态表达。ISH进一步验证了Cryab、Hs3st4、Rprml等基因的SP特异性。

**讨论总结与结论**
讨论部分指出，胚胎SP的分子异质性和动态变化使标记物鉴定困难，本研究的跨平台方法提高了可靠性。部分标记物（如Cryab）在人类胎儿皮层中标记截短放射状胶质细胞（tRG），而在小鼠SP中表达，提示可能存在跨物种的共性。Npy在兴奋性和抑制性神经元中的差异表达反映了发育阶段特异性调控。整合分析还发现多个标记基因与自闭症相关，支持SP在神经发育脆弱性中的潜在作用。研究结论部分翻译如下：总之，通过整合微阵列、单细胞RNA测序和空间转录组学数据集（包括两个具有稳健产前表达的报告基因小鼠系的单细胞分析），研究人员识别了定义早期不同SP亚群的共享和谱系特异性基因表达特征，并为未来研究这些亚群在早期皮层回路形成和神经发育疾病中的作用提供了框架。将这些新鉴定的标记物与出生日期和命运图谱研究相结合，将有助于区分SpN的瞬时和持久群体。