玉米黄质产出的Winogradskyella schleiferi菌株

《Journal of Basic Microbiology》：Zeaxanthin-Producing Winogradskyella schleiferi Strains

　　

从地中海海水样本中分离出两株产色素的细菌菌株。系统发育分析表明，这两株菌均与Winogradskyella schleiferi Z215同属，但与参考菌株不同，它们能够同化额外的碳源，如d-甘露糖、l-阿拉伯糖、d-甘露醇和柠檬酸盐。研究人员鉴定出玉米黄质（zeaxanthin）是这两株菌产生的主要类胡萝卜素（carotenoid），且主要以全反式构型（all-trans configuration）存在。类胡萝卜素生物合成动力学（carotenoid biosynthesis kinetics）显示，色素生产在生长早期阶段开始，最大产量在48至56小时之间达到（介于1至1.3 mg·L^?1）。两株菌的比产量（specific production yields）分别为0.7和0.9 mg·g^?1。总类胡萝卜素产量受两株菌培养温度的影响。总体而言，这些发现扩展了关于产类胡萝卜素海洋细菌的科学知识，并凸显了这些新分离菌株作为玉米黄质生物技术生产候选菌株的潜力，可应用于从饲料添加剂到黄斑变性（macular degeneration）和黑色素瘤（melanoma）治疗等广泛的新领域。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
类胡萝卜素（carotenoids）是一类天然色素，包括胡萝卜素（carotenes）和叶黄素（xanthophylls），在光合作用、光保护及抗氧化中发挥关键作用。其中，玉米黄质（zeaxanthin, 3R,3′R-β,β-carotene-3,3′-diol）是一种黄色叶黄素，在医疗和食品工业中具有重要价值，如预防年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration）和诱导黑色素瘤细胞凋亡。目前，玉米黄质的主要生产方法为植物提取（如万寿菊），但该方法成本高、能耗大且产量低（约0.3 mg·g^?1干重）。化学合成虽能控制纯度，但会产生非天然立体异构体。生物合成（bioproduction）利用微生物（如微藻、真菌、细菌）可产生天然（3R,3′R）-玉米黄质，但微藻培养需要光照和营养丰富的培养基，成本较高。海洋细菌因其能在低营养、高盐度条件下生存，且污染风险低，成为有前景的替代来源。然而，Winogradskyella属细菌的类胡萝卜素合成潜力尚未被充分研究。本研究旨在从地中海分离两株新的Winogradskyella schleiferi菌株，评估其玉米黄质生产能力，为可持续生物技术生产提供候选菌株。论文发表在《Journal of Basic Microbiology》。

**主要技术方法（不超过250字）**
研究人员从意大利热那亚港湾（Genoa harbor）的海水生物膜（microbial biofilm）中分离出形成黄色菌落的菌株，命名为A和B。通过16S rRNA基因测序、系统发育分析（Maximum Likelihood方法）鉴定菌株分类地位。采用API 20NE鉴定表型特征（酶活性、碳源利用），并测试抗生素敏感性。类胡萝卜素提取采用96%乙醇超声萃取，经薄层层析（TLC）分离，利用高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）鉴定主要色素。生长动力学通过光密度（OD）、干重和菌落形成单位（CFU）监测，类胡萝卜素产量用分光光度法在450 nm处测定，以玉米黄质当量计算。

**研究结果**

**3.1 菌株的分离与鉴定（Isolation and Identification of W. schleiferi Strains）**
- 通过16S rRNA基因序列比对（minimap2）和系统发育树分析，菌株A和B的序列与Winogradskyella schleiferi Z215相似度达99.93%，为同种。这是首次在地中海报道W. schleiferi，此前仅在北海水域发现。
- 表型特征显示，菌株A和B与参考菌株Z215存在差异：它们具有β-葡萄糖苷酶活性（β-glucosidase activity），并能利用d-甘露糖、l-阿拉伯糖、d-甘露醇和柠檬酸盐等额外碳源；对红霉素敏感，但对庆大霉素、青霉素和氨苄青霉素耐药。
- 两株菌最适生长温度为20–30°C，但菌株A在30°C时色素产量最高，菌株B在20°C时最高。

**3.2 类胡萝卜素鉴定（Identification of Carotenoids Extracted from W. Schleiferi A and B）**
- TLC分离后，主色素在硅胶板上Rf值为0.42，紫外-可见光谱显示最大吸收峰在450 nm，并有两个肩峰（420 nm和475 nm），符合玉米黄质特征。
- LC-MS分析显示质子化分子[M+H]⁺在m/z 569.5，[M+NH₄]⁺在m/z 586.5，与玉米黄质分子量一致。
- HPLC色谱图出现两个峰，保留时间（Rt）分别为2.9和3.4 min，对应全反式（all-trans）和顺式（cis）玉米黄质异构体，其中全反式为主。通过吸收峰比例（%III/II）确认，全反式异构体占优。这证实两株菌能合成玉米黄质。

**3.3 类胡萝卜素产量（Carotenoid Production by W. Schleiferi A and B）**
- 菌株A适应期约6小时，指数生长期后于30小时达到最大干重1.7±0.1 g·L^?1，最大比生长速率（μ_max）为0.18 h^?1，代时为3.8小时。类胡萝卜素产量在24小时迅速升至0.88±0.06 mg·L^?1，48小时达最大值0.99±0.01 mg·L^?1，比产量为0.7 mg·g^?1干重。
- 菌株B适应期和指数期与A相似，但衰亡期在56小时内未出现，最大干重1.4±0.4 g·L^?1（56小时），μ_max为0.11 h^?1，代时6.4小时。类胡萝卜素产量随时间线性增加，56小时达1.31±0.14 mg·L^?1，比产量为0.9 mg·g^?1干重。

**讨论与结论**
研究人员在讨论部分指出，新分离的W. schleiferi菌株因能利用多种碳源，比北海水域参考菌株Z215更具适应性，有利于可持续生物技术生产。此前未见Winogradskyella属的类胡萝卜素生产潜力研究，本研究首次深入鉴定了其主色素为玉米黄质，并分析了生产动力学。类胡萝卜素产量与生物量增长趋势相似，提示玉米黄质可能属于初级代谢产物（primary metabolite），这对大规模生产有利，因为最大化生物量即可最大化产量。菌株B在离心后上清液中仍保留橙色色素，可能因产生胞外聚合物（EPS），需用乙醇沉淀回收EPS中的色素，对下游工艺提出挑战。与已知产玉米黄质微生物比较，W. schleiferi的比产量（0.7–0.9 mg·g^?1）与一些海洋细菌（如Cyanobium sp.、Nubsella zeaxanthinifaciens）相当，低于高产菌株如Flavobacterium sp.（16 mg·g^?1）和微藻（3–11 mg·g^?1）。但微藻需光照和CO₂供应，且常同时产生叶黄素（lutein），而W. schleiferi只产生玉米黄质，且主要为全反式异构体，便于纯化，适合用于高附加值医药应用（如黄斑变性治疗）。此外，天然菌株避免了基因改造菌株的环境风险。

**结论翻译**：
综上所述，两株新的W. schleiferi菌株首次从地中海分离得到。它们与模式菌株Z215在β-葡萄糖苷酶活性和额外糖类同化能力上存在差异，这赋予了它们更强的营养摄取适应性。菌株A和B合成的主要类胡萝卜素被鉴定为玉米黄质，其产量与生物量增长趋势相似，提示可能为初级代谢产物。菌株A和B的比产量分别为0.7和0.9 mg玉米黄质·g^?1干重。这些发现可吸引更多对Winogradskyella属作为可持续类胡萝卜素生物技术生产候选菌株的关注，特别是W. schleiferi A和B可用于玉米黄质生产。未来需进一步实验优化该有价值色素的生物合成，如测试不同营养源和探究非生物胁迫因子。