STAT3-CCND2轴驱动胃肠化生中增殖性化生前体细胞群体

《Journal of Cellular and Molecular Medicine》：The STAT3-CCND2 Axis Drives a Proliferative Metaplastic Precursor Population in Gastric Intestinal Metaplasia

　　

胃肠化生（GIM）是一种关键的癌前病变，其驱动因素尚不明确，识别其早期增殖和重编程的调控因子是干预的关键。研究人员整合了人类GIM和正常组织的表观基因组-转录组分析，通过双荧光素酶实验验证了靶点，并通过患者来源的胃类器官的单细胞RNA测序（scRNA-seq）绘制了细胞异质性图。使用类器官的功能验证包括通过qRT-PCR和免疫荧光评估STAT₃敲低。STAT₃被鉴定为GIM中低甲基化、上调基因的首要调控因子，并直接反式激活CCND₂。单细胞分析揭示了一个主要的增殖性“循环GIM前体”细胞群体，共表达STAT₃/CCND₂。STAT₃敲低降低了GIM类器官中CCND₂和肠道标志物（CDX₂, MUC₂）的表达。STAT₃–CCND₂轴在早期GIM发病机制中起核心作用，为胃癌的早期检测和化学预防提供了靶点。

**研究背景与问题**
胃腺癌（GC）是全球第五大常见恶性肿瘤和第四大癌症死因，其中肠型胃癌主要通过Correa级联发展，从慢性胃炎、萎缩性胃炎、胃肠化生（GIM）进展至异型增生和浸润癌。GIM作为关键癌前病变，其分子驱动因素尚不明确。尽管幽门螺杆菌（H. pylori）感染是主要环境诱因，但部分患者根除后化生仍持续存在，提示存在自我维持的表观遗传重编程机制。传统组织分析无法解析胃黏膜中上皮、干细胞、祖细胞及免疫细胞的细胞异质性，且DNA甲基化如何调控转录因子（TFs）及TFs如何驱动GIM相关靶基因的机制仍不清楚。因此，需整合多组学与单细胞技术以识别GIM早期增殖和重编程的调控因子。研究人员开展本研究，旨在阐明GIM发病机制并探索逆转可能。论文发表在《Journal of Cellular and Molecular Medicine》。

**主要关键技术方法**
研究人员从公共数据库GEO（登录号GSE210995）获取GIM和正常胃类器官的转录组与甲基化数据集，通过Starburst图分析鉴定启动子甲基化与基因表达负相关的基因。利用Enrichr平台及TRRUST数据库进行转录因子（TFs）富集分析。对22个人类胃类器官样本（包括未分化和分化类器官，来源于正常和GIM患者）进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），经Seurat、Harmony等算法处理并降维聚类。通过双荧光素酶报告实验和染色质免疫沉淀（ChIP）结合qPCR验证STAT3对CCND2启动子的直接结合。在GIM类器官中通过慢病毒介导的STAT3敲低进行功能验证，采用qRT-PCR和免疫荧光（IF）检测基因和蛋白表达。此外，收集3例GIM患者（来自郑州大学第五附属医院）的胃镜活检组织，进行免疫组化（IHC）检测Correa级联中pSTAT3和CCND2的表达，并用H. pylori SS1菌株感染GES-1细胞进行Western blot分析。

**研究结果**
**3.1 启动子甲基化调控的基因在GIM中被鉴定**
通过整合正常与GIM类器官的启动子甲基化和基因表达数据，发现69个基因的表达与启动子甲基化水平呈负相关，其中40个基因呈低甲基化上调（Hypo-Up），29个基因呈高甲基化下调（Hyper-Down）。对这些上调基因进行TFs富集分析，发现CDX2、STAT1和STAT3显著富集。

**3.2 转录因子富集提示STAT3为关键上游调控因子**
在GIM类器官转录组中，STAT3与其预测靶基因CCND2显示出最强的正相关性（r=0.566，p=5.399e-06），而STAT1与其靶基因的相关性较弱。双荧光素酶报告实验证实STAT3过表达可显著增强CCND2启动子活性。ChIP-qPCR进一步证明pSTAT3（Tyr705）特异性结合于CCND2启动子区域（位点1，TSS -923 bp），直接激活其转录。

**3.3 通过未分化胃类器官的单细胞转录组图谱揭示细胞异质性**
对未分化胃类器官进行scRNA-seq分析，经批次校正后鉴定出18个转录不同的细胞簇，并注释为10种主要细胞状态，包括胃干细胞、增殖性祖细胞（循环祖细胞、S/G2M期细胞）以及GIM定向谱系（如循环GIM前体细胞）。

**3.4 GIM类器官以高增殖、GIM定向的祖细胞为主**
比较正常与GIM类器官的细胞组成，发现GIM类器官中循环GIM前体细胞（Cluster 11）和GIM定向祖细胞（Cluster 16）显著扩增（>95%来源于GIM样本）。单细胞水平Spearman相关性分析显示STAT3与CCND2在多种细胞类型中呈显著正相关。

**3.5 pSTAT3和CCND2在Correa级联中逐步上调并被H. pylori感染诱导**
IHC染色检测正常胃黏膜、轻度GIM、重度GIM、异型增生和GC组织中pSTAT3和CCND2的表达，发现两者随组织学进展逐步显著升高。Western blot显示H. pylori感染GES-1细胞后，pSTAT3和CCND2蛋白水平显著上调。

**3.6 STAT3在基因水平正调控CCND2、CDX2和MUC2的表达**
qRT-PCR检测显示，GIM类器官中STAT3、CCND2、CDX2和MUC2的mRNA水平显著高于正常类器官；STAT3敲低后，这些基因的表达均显著下降，表明STAT3在转录水平正调控这些基因。

**3.7 STAT3在蛋白水平促进CCND2、GIM标志物和干性标志物的表达**
IF染色显示，GIM类器官中pSTAT3、CCND2、CDX2、MUC2以及干性标志物LGR5和SOX9的蛋白表达均高于正常类器官；STAT3敲低后，上述蛋白表达均显著降低，证实STAT3在维持GIM细胞干性中的关键作用。

**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究通过多组学整合、单细胞转录组图谱及系统功能验证，揭示了STAT3-CCND2轴在GIM启动和进展中的核心作用。该轴将经典炎症/应激通路（STAT3）与细胞周期机器（CCND2）直接耦合，为GIM中普遍存在的上皮过度增殖提供了分子解释。单细胞分析将STAT3-CCND2活性定位于“循环GIM前体”细胞群，该细胞群在GIM中显著扩增，且依赖于STAT3维持干性。H. pylori感染可诱导该轴激活，进一步支持其作为早期事件驱动因子的角色。此外，STAT3同时上调肠道标志物CDX2和MUC2，提示其协调增殖与分化程序。研究结论翻译如下：总之，本研究系统阐明了STAT3-CCND2轴在GIM中的核心作用，表明它在Correa级联中逐步激活，被H. pylori诱导，并且对于维持化生病变中的干性至关重要。该轴通过驱动增殖性前体细胞群体以及协调增殖和分化，满足了化生的双重需求：细胞数量和细胞身份。研究人员的发现为胃癌发生中的未来诊断和靶向拦截策略提供了基础。