锶取代羟基磷灰石增强3D打印马铃薯淀粉支架用于体外生物学响应评估

《Materials Today Advances》：Strontium-substituted hydroxyapatite reinforced 3D-printed potato starch scaffolds for in vitro biological response evaluation

　　

本研究旨在评估使用挤出式3D打印（3D printing）技术制备基于马铃薯淀粉（potato starch）基质并增强以羟基磷灰石（hydroxyapatite, HA）和锶取代磷灰石（strontium-substituted apatite）的生物相容性支架的可行性。通过湿法合成的矿物显示出纳米尺度的形态特征（扫描电子显微镜，SEM），而X射线衍射（XRD）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）证实了预期的磷灰石相。锶取代诱导晶格畸变并降低结晶度，从而影响离子释放行为。流变学分析确认了假塑性（pseudoplastic）行为，支持在打印过程中具有良好的可打印性和结构稳定性。锶的掺入有助于提高机械强度，达到高达45.8 kPa的值。支架在21天内表现出有限的降解，表明适用于需要临时结构支撑的应用。电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析证实了持续的Sr²⁺释放，可能有助于生物活性响应。体外生物学实验表明成骨细胞代谢活力增加，并可能减少破骨细胞相关活性，尽管这些观察基于初步和部分定性分析。因此，这些结果表明，掺入锶取代磷灰石的淀粉基复合支架作为骨组织工程（bone tissue engineering）应用的有前景平台具有潜力。然而，需要进一步的体外和体内研究来验证这些发现并评估所开发支架的长期生物学性能。

**论文解读：锶取代羟基磷灰石增强3D打印马铃薯淀粉支架的体外生物学响应评估**

**一、研究背景与问题**

临界尺寸骨缺损（通常>8 mm）因自愈能力受损而成为重大临床挑战，常需采用先进再生策略，如三维支架。挤出式增材制造（即3D打印）因其能精确控制孔隙几何形状和结构组织，成为构建骨再生支架的有力平台。在生物活性陶瓷中，羟基磷灰石（HA）因化学相似于生物磷灰石且具有固有骨传导性而广泛研究。然而，化学计量HA存在重要局限，包括低吸收率、某些生理环境下有限的生物活性以及缺乏内在骨诱导性，可能限制其在骨再生中的应用。值得注意的是，生物磷灰石因离子取代而表现出成分可变性，这在骨重塑和稳态中起重要作用。在此背景下，锶（Sr）的掺入因能调节骨相关细胞反应（可能促进成骨活性并减少破骨吸收）而备受关注。此外，Sr²⁺掺入可影响晶格结构和离子释放行为，进而影响磷灰石基材料的生物学性能。然而，将离子取代陶瓷整合到可打印系统中仍具挑战，因其可能损害流变行为、可打印性和结构稳定性。天然聚合物，如马铃薯淀粉，因可生物降解、细胞相容性好且可调物理化学性质，成为有前景的支架基质。但基于淀粉的水凝胶通常在生理条件下机械强度和结构稳定性有限，限制了其在骨组织工程中的应用。为此，研究人员开展本研究，旨在系统探究将锶取代磷灰石整合到马铃薯淀粉基可打印系统中，评价其可行性及综合性能。

**二、研究内容与结论**

研究人员通过湿化学沉淀法合成了羟基磷灰石（HA）、部分锶取代羟基磷灰石（HA50Sr）和完全锶取代磷灰石（HA100Sr），将其与天然马铃薯淀粉混合制备复合水凝胶墨水，采用挤出式3D打印（Direct Ink Writing, DIW）制造支架，并系统表征了矿物组成、流变行为、可打印性、结构稳定性、降解特性、力学性能及体外生物学响应。得出结论：锶取代诱导晶格畸变和结晶度降低，影响离子释放；流变学确认假塑性行为，支持良好可打印性；锶掺入提高机械强度至45.8 kPa；支架在21天内降解有限；ICP-MS证实持续Sr²⁺释放；体外成骨细胞代谢活力增加，破骨细胞相关活性可能降低。该研究首次系统结合马铃薯淀粉基DIW支架与锶取代磷灰石，为可持续平台设计提供新见解。论文发表在《Materials Today Advances》。

**三、主要关键技术方法**

1. **矿物合成与表征**：采用湿化学沉淀法合成HA、HA50Sr和HA100Sr，利用X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、扫描电子显微镜-能谱（SEM-EDS）和动态光散射（DLS）分析晶体结构、化学基团、形貌及粒径。
2. **复合水凝胶墨水制备与流变学评估**：将马铃薯淀粉与矿物混合加热凝胶化，通过流变仪测定剪切应力-剪切速率曲线（Herschel-Bulkley模型）、应变扫描、频率扫描及触变性，评估假塑性、屈服应力及结构恢复能力。
3. **3D打印支架制造与结构表征**：使用Ender-3 V1打印机（适配水凝胶挤出）以优化参数打印圆柱形支架，通过偏差指数（DI）和有效孔隙率（EM）评价打印精度，利用冻干引入微孔。
4. **理化性能测试**：包括溶胀实验（α-MEM培养液）、降解实验（质量损失法）、压缩测试（纹理分析仪，70%应变）及ICP-MS分析Sr²⁺释放动力学。细胞系来源：MC3T3-E1前成骨细胞（小鼠）和RAW 264.7单核/巨噬细胞（小鼠，用于破骨细胞分化）。

**四、研究结果介绍**

**1. 第一步：羟基磷灰石与锶取代磷灰石表征**
通过XRD分析，HA呈六方晶系，HA50Sr因Ca²⁺与Sr²⁺竞争晶格位点而呈现非晶相，HA100Sr显示锶磷灰石特征峰。FTIR证实PO₄^3-、OH^-及吸附水振动。SEM显示三种矿物均为纳米级球形颗粒，易团聚。DLS测得HA平均粒径321 nm，HA50Sr为251 nm，HA100Sr为338 nm，Zeta电位随Sr取代而降低（-22.6至-6.0 mV），表明静电稳定性下降。EDS确认Ca/P、(Ca+Sr)/P和Sr/P比值接近理想值，但HA50Sr中Sr含量略低于理论值。

**2. 第二步：复合水凝胶墨水表征**
可打印性评估显示，矿物掺入未显著改变边缘厚度及偏差指数（DI），但增加了有效孔隙率（EM）。流变学测试表明所有墨水均呈假塑性（n<1），Herschel-Bulkley模型拟合良好（R²>0.998）。掺入矿物后，屈服应力（τ₀）在NPS-HA中升高，而在NPS-HA50Sr和NPS-HA100Sr中降低（润滑效应）。损耗因子（tan δ）低于1，且矿物掺入后降低，表明弹性增强。频率扫描显示G′>G″，固体弹性行为。触变性测试显示粘度恢复率>50%，利于打印。

**3. 第三步：骨支架表征**
**(a) 锶取代羟基磷灰石对溶胀、降解和力学性能的影响**
溶胀实验显示，复合支架溶胀率较纯淀粉支架（NPS-Control）增加约5%，2小时后趋于稳定。降解21天后，所有支架剩余质量>96%，仅NPS-Control在21天后有显著质量损失，而复合支架因Ca²⁺/Sr²⁺交联作用降解更慢。压缩测试表明，矿物掺入显著提高压缩强度：NPS-Control为10.9 kPa，NPS-HA为22.7 kPa，NPS-HA50Sr为32.9 kPa，NPS-HA100Sr达45.8 kPa，增强归因于Sr²⁺促进淀粉交联。

**(b) 电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析Sr²⁺释放**
NPS-HA50Sr支架释放遵循零级动力学（k₀=0.08 ppm h^-1，R²=0.97），NPS-HA100Sr遵循二级动力学（k₂=4.81×10^-5 ppm^-1h^-1，R²=0.98）。336小时后Sr²⁺浓度达40-122 ppm，高于文献报道的体外成骨刺激阈值。

**(c) MTT实验与TRAP染色的生物学响应评估**
MTT实验显示，含锶支架在第7天和第14天均显著提高成骨细胞（MC3T3-E1）代谢活力，尤以NPS-HA100Sr为最。TRAP染色定性提示，随锶含量增加，破骨细胞（RAW 264.7分化）相关活性可能降低，但缺乏定量分析。研究指出需进一步验证成骨标志物（如碱性磷酸酶ALP、骨钙素OCN、Runx2）。

**五、讨论与结论总结**

**讨论部分**：研究人员指出，锶取代通过晶格畸变和表面离子迁移增强了与淀粉羟基的配位交联，从而提升力学性能。Sr²⁺的持续释放可能通过调节骨重塑相关细胞反应（促进成骨、抑制破骨）发挥生物活性，但当前生物学数据仅为初步定性。此外，支架降解缓慢（21天>96%）有利于临时支撑，而溶胀能力有助于填充骨缺损。局限性包括仅进行体外实验、缺乏长期细胞行为及成骨机制研究。

**结论部分翻译**：本研究表明，利用挤出式3D打印制备基于马铃薯淀粉基质并增强以羟基磷灰石和锶取代磷灰石的生物相容性支架是可行的。据研究人员所知，这是首批系统结合马铃薯淀粉基直接墨水书写（DIW）支架与锶取代磷灰石，并探究矿物取代、流变行为、可打印性、力学性能、离子释放及体外生物学响应之间关系的研究之一。通过湿法合成的矿物呈现纳米结构形态（SEM），XRD和FTIR确认了预期的磷灰石相。锶取代诱导晶格畸变并降低结晶度，从而影响离子释放行为。流变学分析确认了假塑性行为，支持在打印过程中具有良好的可打印性和结构稳定性。锶的掺入有助于提高机械强度，达到高达45.8 kPa。支架在21天内表现出有限的降解，表明适用于需要临时结构支撑的应用。ICP-MS分析证实了持续的Sr²⁺释放，可能有助于生物活性响应。体外生物学实验表明成骨细胞代谢活力增加，并可能减少破骨细胞相关活性，尽管这些观察基于初步和部分定性分析。因此，这些结果表明，掺入锶取代磷灰石的淀粉基复合支架作为体外骨组织工程模型和未来转化研究的平台具有潜力。与以往主要基于海藻酸盐、明胶或合成聚合物体系的研究不同，本工作证明了可持续淀粉基质作为可打印和生物活性平台用于控制Sr²⁺递送的潜力。总之，这些发现确立了马铃薯淀粉作为用于制造释放Sr²⁺的生物活性支架的有前景的可持续平台，并为骨组织工程应用中天然衍生生物材料的设计提供了新见解。