GenX暴露诱导hESC衍生的脑类器官中的神经发育损伤和突触毒性

《Materials Today Bio》：GenX exposure induces neurodevelopmental impairment and synaptic toxicity in hESC-derived cerebral organoids

　　

GenX，也称为六氟环氧丙烷二聚酸（HFPO-DA），于2009年作为全氟辛酸（PFOA）的一种声称更安全的替代品被引入。然而，近二十年的使用已引起越来越多的安全性担忧，因为其被报道与多种器官损伤有关。然而，只有少数研究系统评估了GenX暴露神经毒性的分子机制。在本研究中，研究人员旨在利用人胚胎干细胞（hESC）衍生的脑类器官，研究GenX在皮质发育过程中诱导的神经发育损伤和突触毒性。研究人员发现，早期暴露于GenX导致类器官尺寸减小，并引起基底神经祖细胞（NPC）增殖的浓度依赖性缺陷。此外，分化前的GenX暴露损害了突触形成，并减少了兴奋性突触的数量。研究人员还发现，早期GenX暴露破坏了神经活动，并改变了神经网络组织。RNA测序（RNA-seq）和基因本体论（GO）分析显示，这些效应与神经肽信号通路、突触组装和突触后组织的失调相关。总之，这些神经发生和神经活动的损伤表明GenX具有神经毒性效应，并可能构成神经发育障碍的潜在风险因素。

全氟和多氟烷基物质（PFASs）因其高耐用性和防水性被广泛工业应用，但暴露与多种不良健康结局相关。全氟辛酸（PFOA）关联代谢紊乱、先天畸形和神经发育疾病，促使开发替代品。2009年引入的六氟环氧丙烷二聚酸（HFPO-DA，即GenX）作为PFOA的替代品，但其毒理学特征尚不充分。环境监测显示GenX存在于地表水、地下水及饮用水中，动物研究提示其可影响肝脏、胰腺和肾脏，并可能通过母体暴露造成子代神经发育风险。大脑发育依赖于神经祖细胞（NPC）自我更新和分化的精确调控，尤其是负责复杂行为的 cerebral cortex（大脑皮质）。GenX对皮质发育和突触活动的影响尚未系统阐明。为此，研究人员利用人胚胎干细胞（hESC）衍生的脑类器官模型，系统评估了GenX暴露对皮质发育、神经发生和突触功能的影响，旨在揭示其神经毒性机制。该研究发表在《Materials Today Bio》。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：从WiCell研究所获取H9 hESC系，使用STEMdiff? Cerebral Organoid Kit进行脑类器官定向分化；通过TUNEL染色检测凋亡；实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和免疫印迹（Immunoblotting）分析基因及蛋白表达；免疫荧光染色（Immunostaining）观察细胞类型和突触标志物；多电极阵列（MEA）系统记录自发神经活动及网络动力学；QuantSeq 3′ mRNA测序进行转录组分析，并利用基因本体论（GO）富集解析差异表达基因（DEGs）的生物学功能。

**3.1 Generation and characterization of hESC-derived cerebral organoids**
通过免疫组织化学染色和RT-qPCR验证，在分化第40天，类器官中SOX2⁺ NPCs沿脑室区（VZ）分布，TBR2⁺中间祖细胞位于邻近的脑室下区（SVZ），MAP2⁺和NeuN⁺成熟神经元分布于外层，TBR1⁺深层皮质神经元位于VZ浅层，GFAP⁺星形胶质细胞出现，且多能性标志物OCT4和KLF4表达消失，而NPC、神经元、皮质层和星形胶质细胞标志物显著上调，证实类器官成功再现了人皮质发育的关键特征。

**3.2 GenX exposure impairs NPC proliferation and reduces cerebral organoid size**
从分化第10天至第40天暴露于GenX后，类器官尺寸呈浓度依赖性减小（10 μM和100 μM时第20天分别减小23.0%和34.4%，第30天分别减小18.0%和35.0%）。TUNEL染色未见凋亡细胞显著增加，表明尺寸减小源于生长抑制而非凋亡。第20天H&E染色显示，100 μM GenX暴露使VZ面积减小21.0%，Rosette直径减小38.3%，顶侧和基侧长度分别减小42.1%和30.4%，但顶基比不变。SOX2⁺区面积（VZ厚度）在10 μM和100 μM下分别减小约25.3%和38.7%，SOX2⁺/Ki-67⁺增殖性NPC比例分别降低约7.8%和26.0%，表明GenX通过抑制NPC增殖导致皮质扩张受损。

**3.3 GenX exposure disrupts neuronal distribution and cortical marker expression**
第40天RT-qPCR显示，GenX暴露浓度依赖性地下调NPC标志物PAX6和Nestin、神经元标志物MAP2和NeuN、皮质层标志物TBR1和CTIP2以及星形胶质细胞标志物GFAP和S100β的mRNA水平。免疫荧光定量证实，NeuN⁺细胞在10 μM和100 μM下分别减少30.7%和55.6%，GFAP⁺细胞分别减少53.8%和82.7%，TBR2⁺中间祖细胞分别减少12.5%和64.4%，CTIP2⁺深层皮质神经元分别减少62.5%和80.7%，说明GenX破坏了神经发生和星形胶质生成。

**3.4 GenX exposure disrupts synaptogenesis and neuronal activity**
第40天免疫染色显示，VGLUT1（兴奋性突触）puncta密度在10 μM和100 μM下分别降低12.4%和55.5%，VGAT（抑制性突触）puncta密度也呈浓度依赖性降低。免疫印迹分析表明，突触前蛋白Synaptophysin和GAD67，以及突触后蛋白PSD95和Gephyrin均不同程度下调。MEA记录显示，GenX暴露后活性电极数量、加权平均放电率、爆发频率和爆发持续时间均呈浓度依赖性降低，表明自发神经活动和同步化网络行为受损。

**3.5 GenX exposure alters transcriptomic profiles**
QuantSeq 3′ mRNA测序鉴定出差异表达基因（DEGs）。10 μM GenX暴露后，上调基因富集于DNA模板转录调控、轴突导向、mRNA剪接正向调控等通路，下调基因富集于非运动纤毛组装、兴奋性突触形成、溶酶体转运、背腹侧模式形成和雌激素反应。100 μM GenX暴露后，关键神经发育调节因子DSCAML1、WNT7A、SEMA4A和FABP7显著下调，经RT-qPCR验证呈浓度依赖性降低；同时GDA和XDH上调，GO富集显示鸟嘌呤、GMP和脱氧鸟苷分解代谢过程激活，提示嘌呤分解代谢和氧化应激响应增强。

讨论部分指出，GenX暴露导致脑类器官中神经发生和星形胶质生成受损，与既往PFAS神经毒性研究一致。转录组分析揭示WNT7A、DSCAML1、SEMA4A和FABP7下调与NPC增殖、皮质分层和突触形成缺陷相关，而XDH上调及嘌呤分解通路富集提示氧化应激可能参与毒性机制。研究还讨论了脑类器官模型的局限性，包括缺乏血管、血脑屏障和小胶质细胞，限制了向体内风险的外推。研究结论部分翻译如下：总之，作为PFOA主要替代品的GenX，对神经发育产生类似于其他PFAS（特别是PFOA）的有害效应。利用脑类器官模型，研究人员发现GenX暴露在关键发育阶段减少神经元群体，并破坏突触形成和功能。转录组分析进一步识别出多个神经发育相关生物过程的失调，包括轴突发生、突触组装、神经肽信号和溶酶体功能相关通路，为后续机制研究提供了假设生成框架。然而，这些通路的实验验证未在本次研究中完成，因为主要目标是建立基于脑类器官的表征平台，提供多领域表型证据。后续需专门研究系统验证这些候选机制通路，以全面阐明GenX诱导神经发育损伤的分子基础。